ゲノム情報にもとづくM.Pneumoniaeの細胞構造の理解と病原性の解明

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M.pneumoniaeの全689個のORFのうち200個をInvitrogen社のGatewayシステムのベクターにクローン化した。このうち約100個をEYFPの遺伝子と連結してM.pneumoniaeで発現させ、細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、接着器官に存在することが知られていた7つのタンパク質のうち、HMW1、HMW2、HMW3、P30、P65の5つでは接着器官部分に明るい蛍光が観察され、EYFPタグを付けたことによって局在を視覚化することができた。しかし、P1とORF6はうまく視覚化することができなかった。EYFP蛍光タグ法はM.pneumoniaeのORF産物の細胞内局在を調べる手段としておおむね有効ではあるが、ORFによっては正確な結果が得られない場合があるので注意する必要がある。その他、今回調べたORFのうち、明らかに再現性のある局在パターンを示したのは約10個だった。P41、P24、P200は、接着器官の基部に局在していることが観察された。これらはM.penumoniaeをTritonX-100で処理した時に不溶画分に残ることからも、細胞骨格成分であると考えられる。また酵素と考えられる数個のORF産物と、機能未知のORF産物も接着器官付近に局在した。現在これらの接着器官部位での局在をさらに確認している。再現性のある局在パターンを示したORF産物についてはEYFPとECFPの二つの蛍光タグを用いて局在部位の比較を行った。この方法の分解能は比較的高く、数十nm程度の局在部位の違いを蛍光像のずれとして検出できた。この分析からは、これまで免疫蛍光法では同じ部位に存在していると考えられていたHMW1とHMW3タンパク質が、HMW3の方が接着器官の末端側にHMW1はより基部側に存在していることがわかった。