線虫を用いたRNAi関与因子の遺伝子的同定と機能解析

利用秀丽隐杆线虫进行 RNAi 相关因子的遗传鉴定和功能分析

• 批准号: 17026020
• 负责人: 田原 浩昭
• 金额: $ 3.39万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17026020/
• 关键词: RNAi; 線虫; C.elegans

RNAi(RNA interference)とは真核生物の細胞に二本鎖RNAを導入した場合に相同配列を持つ遺伝子の発現抑制が生じる現象であり、遺伝子発現を制御する新しい手段として有用である。我々は線虫C.elegansをモデル生物として用いてRNAiの反応機構について生化学と遺伝学を組み合わせた研究を行った。生化学的な解析を進めるために、初年度およびその準備期間に、線虫の細胞抽出液を用いてRNAiを再現する無細胞反応系を独自に開発してきた。本年度は開発した無細胞反応系を用いて、RNAiにおける標的mRNAの切断反応およびシグナル増幅機構について解析した。まず、無細胞系へmRNA及び合成siRNAを導入する実験によって、mRNAの配列特異的な切断(Slicer)活性の検出を行った。興味深いことに、線虫におけるSlicer活性は2本鎖のsiRNAよりも1本鎖のsiRNAでより強く誘導できるという特徴を持つことが分かった。又、植物や菌類そして線虫においてはRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)がRNAi反応に必要とされることが知られており、そのRdRP活性を無細胞系で検出することを試みた。その結果、不完全な形状のmRNAを鋳型として22〜23塩基長の小分子RNAを合成するRdRP活性を検出できた。この活性は、RNAi反応機構の下流において標的mRNAを鋳型として2次的siRNAが産生されるシグナル増幅反応に対応するものと考えられる。又、既知のRNAi欠損変異体の中の数種類がRdRP活性の異常を示すことも判明した。

RNAi(RNA interference) and eukaryotic cells in the introduction of two-lock RNA, the same sequence of the same gene expression inhibition phenomenon, gene expression control new methods and useful. We have been studying the biological and biological mechanisms of C.elegans in the field of RNAi. Biochemistry analysis, early stage and preparation period, cell-free reaction system with RNAi reproduction This year, we have developed a cell-free response system for the analysis of RNAi target mRNA cleavage and amplification mechanisms. The expression of mRNA and synthetic siRNA was detected by sequence specific cleavage of mRNA. Slicer activity is strongly induced by siRNAs of 2-locus and siRNAs of 1-locus. In addition, plants and fungi have RNA-dependent RNA primers (RdRP) that are necessary for RNAi reaction. As a result, incomplete mRNA patterns and 22 to 23-mer RNA synthesis were detected. This activity is linked to the expression of mRNA in the downstream of the RNAi response mechanism, and the expression of siRNA is linked to the expression of mRNA in the downstream of the RNAi response mechanism. In addition, several types of RdRP activity abnormalities in known RNAi deficiency variants were identified.