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2光子励起法を用いたSNAREタンパク質複合体による開口放出過程の機能解析

使用双光子激发法对 SNARE 蛋白复合物的胞吐过程进行功能分析

基本信息

批准号：
17049028
负责人：
根本知己
金额：
$ 3.33万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度に引き続き、SNARE連関タンパク質など開口放出過程に関係する分子群の動態の理解を進め、画像解析法を開発する為に、膵臓β細胞初代培養標本、クロム陽性細胞初代培養クラスター標本を用いて、分泌顆粒の動態や、SNARE分子が開口放出を誘引する中間過程の可視解析を進めた。その結果、膵臓β細胞、クロム陽性細胞において、以下のような成果を得た。(1)膵臓β細胞におけるインシュリン開口放出の初期モード古典的な光学顕微鏡の空間分解能を下回る細胞内小胞の大きさを定量的に解析する方法論を確立し、TEPIQ法と名付けた。膜染色蛍光色素及び低分子量水溶性蛍光分子を含む細胞外液で灌流し、細胞外部空間をネガティブに染色させ、小胞動態を可視化解析する。その方法論を総説として出版した。その方法を用いて、膵臓β細胞におけるインシュリン小胞のカルシウム依存性開口放出過程を検討し、その動態制御機構に関する重要な知見を得、原著論文として発表した。(2)クロム陽件細胞におけるt-SNARF分子の側方拡散細胞膜に局在するSNAREコアタンパク質の集積状態を2光子断層イメージングと蛍光免疫染色法により比較検討する方法論を確立した。さらに、TEPIQ法に加え、細胞に負荷したケージドカルシウム試薬(NP-EGTA-AM体)を紫外線閃光照射により活性化させることにより、瞬時に細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させ、開口放出を誘起させた。その結果、クロム陽性細胞において、融合した分泌顆粒膜へ蛍光化t-SNARE分子の側方拡散が観察された。これより、逐次開口放出にはt-SNARE分子の側方拡散が必要であることが示唆され、我々の提唱する逐次開口放出の分子モデルを支持する結果が得られた。また我々はバキュオール型逐次開口放出が存在することを初めて実証した。これらの成果を原著論文として出版した。

In the past year, the understanding of the dynamics of molecular populations related to SNARE linkage, the development of portrait analysis methods, the use of primary culture of beta cells, the use of primary culture of positive cells, the dynamics of secretory particles, and the visual analysis of the intermediate process of SNARE molecule opening release have been improved. The results were obtained from β-cells and positive cells. (1)A methodology for quantitative analysis of intracellular microcellular size was established based on classical optical microscopy for the initial phase of β-cell opening release, and TEPIQ method was developed. Membrane staining allows fluorescent pigments and low-molecular-weight water-soluble fluorescent molecules to be contained in extracellular fluid for perfusion, the space outside the cell is stained, and cell dynamics are visualized and analyzed. The methodology of the study was discussed and published. The method is applied to the study of the dependent opening process of β-cells and the important knowledge about the dynamic control mechanism. (2)t-SNARF molecules in the lateral dispersion of cell membranes in the presence of T-SNARF molecules. In addition, TEPIQ method was used to increase the intracellular Ca^<2+> concentration, increase the cellular load, and induce the activation of NP-EGTA-AM by ultraviolet flash irradiation. As a result, t-SNARE molecules were observed in the lateral dispersion of secretory granular membranes and in the fusion of positive cells. The results show that the sequential release of t-SNARE molecules is necessary to improve the stability of the molecule. The first step is to open the door and open it. The results of the original paper were published.