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CENP-Aクロマチンリモデリング機構の解明

阐明CENP-A染色质重塑机制

基本信息

批准号：
17050010
负责人：
依田欣哉
金额：
$ 3.9万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究計画は、我々研究グループのこれまでの研究成果から、ヒト培養細胞間期核内より、セントロメアクロマチン(CENP-Aクロマチン)複合体=ICENを単離精製し、40種類のICEN構成蛋白を明らかにした所から出発している(Obuse et al, Genes Cells,9,105-120,2004)。40種類のICEN蛋白の中から、機能未知の蛋白7種類について、遺伝子の全長をクローニングし、EGFP遺伝子との融合遺伝子を作成し、ヒト細胞に導入し、安定トランスフォーマント株を作成した。7種類のICEN蛋白(ICEN22,24,32,33,36,37,39)が細胞周期を通して、セントロメアに局在する事を明らかにした。さらに、7種類それぞれのICEN蛋白をsiRNAによりノックダウンすることにより、染色体分配に異常が生じ、高頻度に染色体異数体が生じる事を示した。以上の結果から、7種類のICEN蛋白が染色体分配に係る新規セントロメア蛋白である事を明らかにした(Izuta et al, Gene Cells,11,673-684,2006)。次に我々は、CENP-Aクロマチン形成機構を明らかにする目的で、ICEN構成因子であるRsf1-hSNF2H(ICEN2-ICEN8,RSF)リモデリング複合体に着目し、研究を進め以下の成果を得た。1.Rsf1(ICEN2),hSNF2H(ICEN8)に対するモノクローナル抗体の作成。細胞染色、ウェスタンブロッティング、クロマチン免疫沈降に使用可能である。特に抗hSNF2H抗体はクロマチン免疫沈降にすぐれた特異性を示し、特にnative-クロマチンの単離精製にすぐれている。2.(i)Rsf1及びhSNF2Hが間期にセントロメア局在する。(ii)siRNAによるRsf1除去により核内におけるCENP-Aの量が顕著に減少し、prometa期からmeta期への進行が顕著に遅滞する。(iii)siRNA除去により、EGFP-CENP-Aのセントロメア局在が阻害される。(iv)in vitro再構成系により精製RSF複合体はCENP-Aヌクレオソーム形成活性及びスペーシング活性を有する。以上の結果から、我々はICEN構成因子に含まれる唯一のヌクレオソームリモデリング因子であるRSF複合体が、CENP-Aクロマチン形成因子であると結論した。(論文投稿中)

This research project is based on the results of our previous research on the development of CENP-A complex (ICEN) in cultured interphase nuclei (Obuse et al, Genes Cells,9,105- 120, 2004). 40 kinds of ICEN protein in the middle, function unknown protein 7 kinds of protein, gene length, EGFP gene fusion gene production, cell introduction, stable gene production 7 kinds of ICEN proteins (ICEN22,24,32,33,36,37,39) are important for the cell cycle. 7 kinds of ICEN protein siRNAs were detected, and chromosome distribution was abnormal. The results showed that 7 kinds of ICEN proteins were assigned to chromosomes according to new rules (Izuta et al, Gene Cells,11,673- 684, 2006). Secondly, we have achieved the following results for the purpose of clearly defining the CENP-A Kouromacon formation mechanism and the ICEN component Rsf1-hSNF2H (ICEN2-ICEN8,RSF) complex. 1. Rsf1 (ICEN2), hSNF2H (ICEN8) for the preparation of antibodies. Cell staining, Specific anti-hSNF2H antibodies are characterized by specific immunoprecipitation, specific native-immunoprecipitation and purification. 2. (i) Rsf1 and hSNF2 are separated from each other. (ii)siRNA Rsf1 removal reduces the amount of CENP-A in the nucleus, and the prometa phase continues to slow down. (iii)siRNA removal, EGFP-CENP-A gene transfer, and inhibition. (iv)In vitro reconstitution system, purified RSF complexes have both CENP-A complex formation activity and protein synthesis activity. The above results show that ICEN component factors include the RSF complex and CENP-A component factors. (Paper submission in progress)