周生期の視床下部シナプス形成に及ぼすエストロゲンの作用と作用機序

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本課題は、女性ホルモン(E2)が周生期視床下部ニューロンに及ぼす作用と作用機序について、周生期ラット視床下部細胞の培養系を用いて解明することを目的とした。具体的には本課題では、1.シナプシンIに及ぼすE2の影響ついての解析(発現ベクターを用いた解析、免疫染色法、Immunoblotting法、realtimePCR法による解析)2.エストロゲン作用についてプロテオミクス解析を行う、という2つの方法を用いて実験を行うことを予定した。今年度研究代表者の異動に伴い、ラット視床下部細胞の培養を継続的に行うことが困難となったため、1.については、発現ベクターを用いた実験ができなかったため、synapsinIのリン酸化変化を中心に解析を行った。また2.については、当初の予定通りプロテオミクス解析をおこなった。1.まず、前シナプスタンパク質であるsynapsinIへのE2の影響を調べたところ、E2により蛋白レベルの発現量、mRNA発現量には変化がないが、免疫染色により凝集する領域が増大していることが明らかとなっていた。部位特異的リン酸化シナプシン抗体5種類を用いて調べたところ、サイト1,2,3でのリン酸化がE2により抑えられ、それにより、synapsinIの凝集が起きたことが予想された。また、E2-BSAの添加でも、E2と同様の結果が得られたことから、膜上エストロゲン受容体の関与が示唆された。2.培養視床下部細胞と培養大脳皮質細胞の両者間でE2により発現の異なるたんぱく質を2D-DIGE法により解析した。幾つかの蛋白質スポットが両者間での発現の異なるタンパク質として検出され、それらのスポットについて質量分析を行い蛋白同定を行った。同定されたタンパク質には、細胞骨格タンパク質(アクチン、チュブリンなど)、解糖系の酵素などの他に、ステロイド受容体の修飾因子や転写因子などが含まれていた。これらのタンパク質のいくつかについて、抗体を用いたスポットの確認や転写後修飾、細胞内局在などについて調べた。