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細胞膜受容体の分子挙動と細胞応答の統合的測定技術の開発

细胞膜受体分子行为和细胞反应综合测量技术的开发

基本信息

批准号：
18038017
负责人：
渡辺琢夫
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18038017/
关键词：
FRET 細胞膜受容体オリゴマー化 RAGE 1分子FRET NFκB

项目摘要

1.細胞表面受容体のオリゴマー化モニタリング系の開発細胞膜受容体であるRAGE (receptor for advanced glycation endproducts)をモデルとし、2分子FRET法により受容体オリゴマー化をモニタリングする技術を確立した。これにより、受容体の蛍光タンパク融合組換え体を作製することなくFRETでオリゴマー化をモニタリングすることが可能となった。(1)RAGE細胞外ドメインに結合し、かつRAGEとリガンドとの結合を阻害しないモノクローナル抗体を作製し、FRETのドナーとアクセプターの対をなす2種の蛍光色素で標識した。(2)RAGE過剰発現細胞株の培養液中に上記の2種の蛍光標識抗体を加え、生細胞表面のRAGEを蛍光標識し、RAGEのオリゴマー化をFRETシグナルの変化を測定することによりモニタリングした。(3)その結果、リガンド刺激後20分をピークとするFRETシグナルの上昇が検出され、本技術の有効性が示された。2.1分子FRET法による細胞内シグナルモニタリングと受容体発現量の相関関係の解析細胞内シグナル強度のモニタリングと、受容体の発現量解析を同時に行うことにより、受容体発現量とシグナル強度の相関解析が可能な系を開発した。(1)NFκBの活性化によりβ-ラクタマーゼを発現するレポーター遺伝子を組み込んだ細胞株に、RAGE発現ベクターを導入した。(2)上記細胞にβ-ラクタマーゼによる分解で分子内FRETが消失する蛍光色素分子を取り込ませ、FRETシグナルによりNFκB活性化を検出すると同時に、蛍光抗体でRAGEを標識し発現量を測定した。(3)その結果、RAGE発現量が中程度の細胞において最も強くNFκBが活性化されており、発現量が過剰な細胞ではむしろ活性化の程度が低いことが明らかとなった。

1. The technology of RAGE (receptor for advanced glycation end products) for the development of cell membrane receptors was established by the two-molecule FRET method. For example, if you want to change the color of the image, you can change the color of the image. (1)RAGE cell surface binding, anti-RAGE binding, anti-FRET binding, anti-FRET binding, anti-RAGE binding, anti-RAGE binding, (2) Add two kinds of labeled antibodies to the culture medium of RAGE over-developing cell lines, label RAGE on the surface of cells, change RAGE to FRET, and change RAGE to FRET. (3)The results show that the FRET profile increases 20 minutes after the initial stimulation and the effectiveness of the technique is demonstrated. 2.1 Analysis of the correlation between intracellular concentration and receptor production by molecular FRET method; analysis of intracellular concentration and receptor production; and simultaneous analysis of correlation between concentration and receptor production. (1)NF Activation of κB, β-RAG, RAG (2)In addition, the detection of VEGF and VEGF in the cells was also performed. (3)As a result, RAGE production was moderate and NFκB activity was highest in the cells, while RAGE production was moderate and NF κ B activity was low in the cells.