DNA複製反応の1分子蛍光観察と形態制御技術の開発

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本研究は生化学反応が起きているその場で、しかもリアルタイムで観察できる1分子観察・1分子計測技術をDNA複製反応の解析に適用することを目的とした。18年度までにDNA合成反応の可視化で必要となる1本鎖DNAを蛍光顕微鏡視野内で調製することに成功し、DNA消化酵素exonucleaseIIIが1分子のDNAを消化していく様子を直接観察している。ここで興味深いことに、exonucleaseIIIはDNAを伸張させた状態と弛緩させた状態では消化速度が異なることが示された。そこで本年度は1分子計測に基づくDNA-タンパク質間相互作用の解析ではDNA1分子の形態を制御させながら反応を解析できる点に着目し、DNAの形態とDNA消化反応の関係について実験的に明らかにすることを試みた。その結果、DNAを伸張させた場合には弛緩させた場合と比較してDNA消化速度が2倍以上速くなることが示された。DNAの形態と酵素反応の関係は非常に興味深く、1分子観察技術の利点を生かした研究であるといえる。加えてDNA-タンパク質間相互作用におけるタンパク質の詳細な挙動解析を目的としたタンパク質の蛍光標識法について検討し、DNA-タンパク質間相互作用を阻害しない蛍光標識方法を示した。その例としてDNA複製時に1本鎖DNA (ssDNA)と結合するReplication Protein A (RPA)の蛍光標識を行い、さらにssDNA-RPA複合体の1分子蛍光観察に成功した。以上の結果は、DNA複製反応をはじめとする各種DNA-タンパク質間相互作用への適用が期待され、詳細な挙動の解明に貢献できると考えられる。