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核磁気共鳴による藍色細菌時計蛋白質の相互作用とダイナミクスの研究

利用核磁共振研究蓝藻时钟蛋白的相互作用和动力学

基本信息

批准号：
19042016
负责人：
池上貴久
金额：
$ 3.97万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042016/
关键词：
生物時計核磁気共鳴藍色細菌

项目摘要

近年、生物時計をもつ唯一の原核生物である藍色細菌において、時計に関する蛋白質KaiA, KaiB, KaiCの結晶構造が決定された。興味深いことに、よく知られている遺伝子調節の関与なしに、これらの蛋白質とATPのみで24時間のリズムがin vitroで生じる。本研究の目的は、24時間周期の鍵となるこれら3種類の蛋白質どうしの相互作用を核磁気共鳴(NMR)を用いて直接に原子レベルでリアルタイム観測し、時計発振の基本的メカニズムを解明することである。^2H,^<15>N,^<13>Cで標識したKaiA、KaiB、あるいは、KaiCを調製し、二次元NMR実験である^1H-^<15>N CRINEPTスペクトルを測定した。さらにメチル基のみを^<13>C,^1Hで標識し、それ以外の核を^<12>C,^2Hで標識した試料を調製した。この試料では、メチル基からの信号のみをメチルTROSY法を利用して測定できるので、KaiCのような超高分子量との複合体でも対応できる。KaiCにはリン酸化部位が二カ所あり、それぞれがリン酸化される順序が決まっている。そして、そのリン酸化の順序が周期の進行に同期している。そこで、それぞれのリン酸化状態を模倣した変異体を作成し、それぞれがKaiAあるいはKaiBとどのように相互作用するかを観測した。その結果、明らかにKaiCのリン酸化状態に依存してKaiB-KaiC間の相互作用が変化することが分かり、その相互作用の強さは、24時間周期の進行におけるKaiCのリン酸化、脱リン酸化の順序とほぼ一致することが見出された。一方、KaiAとKaiCの間の相互作用は、KaiCのリン酸化状態には依存しなかった。以上より、24時間周期において、KaiA, KaiB, KaiC蛋白質どうしの相互作用がどのように変化したかを原子レベルで観測でき、立体構造をもとに生物時計のメカニズムを議論することが出来た。

In recent years, the crystal structure of proteins KaiA, KaiB and KaiC has been determined by biological chronology. The relationship between protein and ATP regulation in vitro The purpose of this study is to investigate the interaction between three kinds of proteins in a 24-time period by means of nuclear magnetic resonance (NMR). 2H,^<15>N,^<13>C identification KaiA, KaiB, KaiC modulation, 2D NMR <15>measurement In <13>addition to the core, the core of the sample is also marked<12>. The sample was determined by the method of Trosy, and the ultra-high molecular weight complex was determined by Trosy. KaiC acid site is divided into two parts, and the acid site is divided into two parts. The sequence of acidification is periodic and simultaneous. The acid state of the sample is different from that of the sample. As a result, KaiB-KaiC interaction changes depending on KaiB-KaiC acidification state, and the order of KaiB-KaiC acidification and deacidification is consistent with that of KaiB-KaiC interaction during 24-time period. The interaction between KaiA and KaiC depends on the acidification state of KaiC. The interaction between KaiA, KaiB and KaiC proteins in the above 24-time period is discussed in detail.