直鎖状DNAプロティン・プライミング複製系を構成する遺伝子産物群とその機能

构成线性DNA蛋白启动复制系统的基因产物及其功能

• 批准号: 63615520
• 负责人: 廣川 秀夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Sophia University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1987
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1987 至 1988
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-63615520/
• 关键词: DNA複製; プロティンプライミング; RGD配列; DNAポリメラーゼ

1. DNAポリメラーゼとプライマープロティンとの複合体形成:M2ファージゲノムからDNAポリメラーゼ(pol)およびプライマープロティン(pp)の遺伝子をpKK233-3のtacプロモーター下流にクローニング、大腸菌中で遺伝子産物を発現させた後、高度に精製することが出来た、ヘパリン、セファローズカラムクロマトグラフィーによって両者は単離されるが、その段階までは両蛋白質は分離せず複合体として精製される。この複合体は、グリセリン密度遠心法によって約94KDの単一画分として回収され、SDS・PAGEによりpolとppに分離し、その量比は1:1であった。2. 精製ppの活性:精製ppはin vitro M2DNA複製系において.DNA複製プライミング活性を示した。一方プライミング反応に引き続いて生ずるDNA鎖伸長合成では、ppがpol活性を阻害すること初めて示すことが出来た。3.M2palの構造解析・M2pol遺伝子(geneG)の塩基配列を決定し推定アミノ酸配列を近縁のφ29polのそれと比較した。両者間で81%の相同性が示された。さらに各種のDNAポクメラーゼとの間で強く保存されている区部の存在が明らかとなり、それらは、DNAポリメラーゼに共通な機能に関係する基本構造と推定された。4.RGDによるM2DNA複製阻害:pp中にアルギニン・グリシン・アスパラギン酸(RGD)の配列が見出された。DNAトランスクエクンエン系にRGDを加えることにより明瞭な阻害が示された。in vitro DNA複製系においてもRGDは、プロティンプライミングによって生ずるppとdAMP複合体(イニシエイション複合体)の形成を阻害する。ppにはRGD配列と、それを認識するRDG受容部位の存在を示唆するものであり、この分子認識能によってプロティンプライミングが開始される。

1. DNA ポ リ メ ラ ー ゼ と プ ラ イ マ ー プ ロ テ ィ ン と の complex formation: M2 フ ァ ー ジ ゲ ノ ム か ら DNA ポ リ メ ラ ー ゼ (pol) お よ び プ ラ イ マ ー プ ロ テ ィ ン (pp) の posthumous son 伝 を pKK233-3 の tac プ ロ モ ー タ ー obscene に ク ロ ー ニ ン グ, coliform で heritage 伝 zi chan content を 発 now さ せ た after , highly に refined す る こ と が た, ヘ パ リ ン, セ フ ァ ロ ー ズ カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ っ て struck the は 単 from さ れ る が, そ の Duan Jie ま で は struck protein separation は せ ず complex と し て refined さ れ る. こ の complex は, グ リ セ リ ン density far art に よ っ て about 94 kd の 単 a draw points と し て back 収 さ れ, SDS PAGE に よ り pol と pp に separation し, そ の than は 1:1 で あ っ た. 2. Refined pp の activity: refined pp は in vitro M2DNA replication system に お い て. DNA replication プ ラ イ ミ ン を グ activity in し た. One party プ ラ イ ミ ン グ anti 応 に lead き 続 い て raw ず る elongation synthetic DNA lock で は, pp が pol active を resistance against す る こ と early め て in す こ と が た. 3. M2pal の structure, M2pol heritage 伝 child (geneG) の salt base with column を decided し presumption ア ミ ノ acid with column を nearly try の phi 29 pol の そ れ と compare し た. The で81% <s:1> similarity between the two is が shown as された. さ ら に various の DNA ポ ク メ ラ ー ゼ と の で between strong く save さ れ て い る area of の is が Ming ら か と な り, そ れ ら は, DNA ポ リ メ ラ ー ゼ に な common function に masato is す る basic construction と presumption さ れ た. 4. RGD に よ る M2DNA copy resistance against: pp in に ア ル ギ ニ ン · グ リ シ ン · ア ス パ ラ ギ ン acid (RGD) の match column が shows さ れ た. DNA ト ラ ン ス ク エ ク ン エ ン department に RGD を plus え る こ と に よ り clear な resistance against が shown さ れ た. The in vitro DNA replication system に お い て も RGD は, プ ロ テ ィ ン プ ラ イ ミ ン グ に よ っ て raw ず る pp と dAMP complex (イ ニ シ エ イ シ ョ ン complex) の form を resistance against す る. Pp に は RGD column と, そ れ を know す る RDG by parts の exists を in stopping す る も の で あ り, こ の molecular recognition can に よ っ て プ ロ テ ィ ン プ ラ イ ミ ン グ が began さ れ る.