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DNA複製開始におけるプライマ-蛋白質受容塩基種の決定機構に関する基礎研究

DNA复制起始过程中引物-蛋白受体碱基种类决定机制的基础研究

基本信息

批准号：
03640543
负责人：
廣川秀夫
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Sophia University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.本年度前半は、実験材料のファ-ジφ29とM2の大量精製を行った。高密度回転培養装置を用いて一回の培養(2〜3l)で約10^<15>のファ-ジ粒子を生産させる条件を確立した。2.ファ-ジDNAは、ファ-ジ粒子を1ml当り10^<12>以下の稀釈した後、1%SDS存右下フェノ-ルにより抽出し,透析後、C_sCl密度平衡遠心法に単一バンドとして,精製した。これは末端結合蛋白質をDNAに持ったTP・DNA複合体である。3.in vitro DNA複製開始反応系を構成するファ-ジDNAポリメラ-ゼ,およびプライマ-蛋白質の遺伝子をともに発現ベクタ-のtacプロモ-タ-下流にクロ-ニングし、大腸菌中でIPTG誘導後、溶菌させDNAセファロ-ズ,ホスホセルロ-ズ、カラムクロマトグラフィ-により単離精製した。4.精製されたDNAポリメラ-ゼ,プライマ-蛋白質,TP・鋳型DNAによりin vitro DNA複製開始反応を行った。反応生成物(イニシェ-ション複合体・PP・dAMP)の検出は、SDS・PAGE法により蛋白質染色のバンドの位置の確認とRGDペプチドの結合性により判定した。5.本研究の目的であるTP・鋳型DNA3^1末端の改変については、先づM2DNAについてのみ3^1末端より20merヌクレオチド配列を合成し3^1exoヌクレア-ゼ処理したTP・M2DNAとアニ-ルさせた。これをin vitro DNA複製反応系によりPPへのヌクレオチド結合を測定したが、期待通りの複合体生成はみられなかった。実験は現在も進行中である。改変されたTP・鋳型DNAの末端構造の完全さ(インテグリィティ-)に決定的要因があるものと推測している。今後、改変TP・鋳型DNA生成法を改良して、プロティンプライミングDNA複製開始における3^1末端塩基配列の役割・機能を解析する。

1. In the first half of the year, a large number of refined materials were produced. The conditions for particle production were established by using a high density culture apparatus for one cycle of culture (2 ~ 3l) for about 10 minutes<15>. 2. When the concentration of DNA and CsCl in 1ml is less than 10 μ g, the concentration of SDS in 1% is lower than 10 μ <12>g. After dialysis, the concentration of CsCl in 1 ml is lower than 10 μ g. After dialysis, the concentration of CsCl in 1 ml is lower than 10 μ g. TP-DNA complex 3.in vitro DNA replication initiation reaction system composition: DNA sequencing, protein sequencing, development, IPTG induction in Escherichia coli, lysis, DNA sequencing, purification. 4. Refined DNA, protein,TP, DNA, in vitro DNA replication initiation The identification and identification of anti-RGD product (PP·dAMP) by SDS·PAGE were performed to confirm the position of protein stain and the binding of RGD. 5. The purpose of this study is to synthesize TP·M2 DNA from 3^1-terminal to 20-mer terminal. This is the first time in a long time that we've seen a DNA replication system. The present is in progress. Changes in the terminal structure of TP-type DNA are determined by the factors involved. In the future, we will improve the TP-1 DNA generation method and analyze the function of 3^1-terminal base alignment during DNA replication initiation.