直鎖状DNAプロティンプライミング複製系を構成する遺伝子産物群とその機能

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直鎖状DNAをもつバクテリオファージM2およびφ29を用いて, プロティンプライミングDNA複製系を構成する蛋白質:DNAポリメラーゼ(pol)および末端蛋白質(TP)の構造と機能を明らかにすることを目的に以下の実験を行った.1.M2TPおよびM2pol遺伝子のクローニング:TPおよびpolの遺伝子はM2ゲノムの制限酵素EcoRI断片中に位置しいるので, まずこのDNA断片をとり, さらに両遺伝子を含む, 出来るだけ短いDNA断片を得るため, HaeII, PvuI処理を行い, TP・polの両者を含む断片とpolのみを含む断片を調製した. これらを大腸菌プラスミドpKK223-3のtacプロモーター下流に挿入し, pIKM23-1, -2, -3, -4のキメラプラスミドを造成した. tacプロモーターを誘導後, 集菌, 溶菌し, 硫安沈澱により蛋白質粗画分を調製した. この画分はin vitroM2DNA複製系においてプロティンプライミング活性を示した. 現在, 各種クロマトグラフィを用いて活性画分の精製を行っている.2.アフィディコリン(APH)高感受性株の分離:枯草菌ファージM2, φ29はAPH感受性であるが, その程度は真核細胞に比して低い. そこで高感受性変異株の分離を行い, その変異がDNA複製系を構成するどの蛋白質に生ずるかを検討した. その結果, M2のTP温度感受性株から新たに2株の高感受性株を分離出来た. この変異座は, ファージの相補実験からpol, TP以下のシストロンであることが示された. 現在ところ, 遺伝子T(DNA結合蛋白質をコードする)である可能が高いと考えられ, T遺伝子のクローニングを行っている.本年度を通じて, 目的遺伝子のクローニングが進み, 部位特異的変異の導入の材料が整備された.