細胞マイクロアレイ法を用いた自己抗体遺伝子の同定および自己免疫疾患の病態解析

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我々は自己免疫疾患患者の自己抗体を遺伝子レベルでハイスループットな解析を行うために、自己抗原特異的Bリンパ球のクローンレベルでの同定ならびに自己抗体遺伝子のRT-PCRによる増幅ができるような細胞マイクロアレイ法の樹立およびそれを用いた自己免疫疾患の解析を目的として本研究を行ってきた。細胞マイクロアレイ法では、独立したマイクロウェルが規則正しく配置されているアレイ(2cm角に約100万ウェル)を用いて、その各マィクロウェルに1個ずつリンパ球を入れ、抗原で刺激する。抗原によるリンパ球の活性化を蛍光スキャナーで検出することにより抗原特異的リンパ球を同定する。さらに、同定したリンパ球より抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングする。本年度は以下の研究を行った。我々はこれまでに細胞マイクロアレイ法に適した抗原特異的Bリンパ球の検出方法を検討し、確立してきた。また、1個のBリンパ球から抗体遺伝子をRT-PCRにより増幅・クローニングする方法を確立した。1.活性化リンパ球の検出に関しては、これまで細胞内カルシウム濃度の変動を蛍光色素を用いスキャナーで検出し、1個1個の細胞の蛍光強度の画面上での表示を目で比較することにより行ってきた。本年度は、刺激前後の蛍光強度を計算し、それを表示できるソフトウェアを開発し、数値により活性化リンパ球を同定することが可能になった。2.マイクロウェルアレイへの細胞の分注方法を検討し、自然落下による方法や吸引による方法を検討した。アレイへ添加する細胞密度を高めることで95%以上のウェルへ1個ずつ細胞が分注されることを確認した。また、吸引法により細胞密度の低いサンプルを用いて80%以上のウェルへ細胞が導入されることを確認した。3.実際にヒトの細胞を用いたシステムの応用を検討するために、モデルシステムとし、B型肝炎ウィルス表面抗原(HBs抗原)を用いた実験を行い、HBs抗原に特異的Bリンパ球を同定し、HBs抗原に特異的な抗体遺伝子を取得できることを確認した。現在、システムの精度の向上を目指し研究を行っている。