細胞マイクロアレイ法を用いた自己抗体遺伝子の同定および自己免疫疾患の病態解析

细胞芯片法鉴定自身抗体基因及自身免疫性疾病病理分析

• 批准号: 15012220
• 负责人: 岸 裕幸
• 金额: $ 4.93万
• 依托单位: Toyama Medical and Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15012220/
• 关键词: 自己免疫疾患; 自己抗体; マイクロウェルアレイ; スキャナー

我々は自己免疫疾患患者の自己抗体を遺伝子レベルでハイスループットな解析を行うために、自己抗原特異的Bリンパ球のクローンレベルでの同定ならびに自己抗体遺伝子のRT-PCRによる増幅ができるような細胞マイクロアレイ法の樹立およびそれを用いた自己免疫疾患の解析を目的として本研究を行ってきた。細胞マイクロアレイ法では、独立したマイクロウェルが規則正しく配置されているアレイ(2cm角に約100万ウェル)を用いて、その各マィクロウェルに1個ずつリンパ球を入れ、抗原で刺激する。抗原によるリンパ球の活性化を蛍光スキャナーで検出することにより抗原特異的リンパ球を同定する。さらに、同定したリンパ球より抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングする。本年度は以下の研究を行った。我々はこれまでに細胞マイクロアレイ法に適した抗原特異的Bリンパ球の検出方法を検討し、確立してきた。また、1個のBリンパ球から抗体遺伝子をRT-PCRにより増幅・クローニングする方法を確立した。1.活性化リンパ球の検出に関しては、これまで細胞内カルシウム濃度の変動を蛍光色素を用いスキャナーで検出し、1個1個の細胞の蛍光強度の画面上での表示を目で比較することにより行ってきた。本年度は、刺激前後の蛍光強度を計算し、それを表示できるソフトウェアを開発し、数値により活性化リンパ球を同定することが可能になった。2.マイクロウェルアレイへの細胞の分注方法を検討し、自然落下による方法や吸引による方法を検討した。アレイへ添加する細胞密度を高めることで95%以上のウェルへ1個ずつ細胞が分注されることを確認した。また、吸引法により細胞密度の低いサンプルを用いて80%以上のウェルへ細胞が導入されることを確認した。3.実際にヒトの細胞を用いたシステムの応用を検討するために、モデルシステムとし、B型肝炎ウィルス表面抗原(HBs抗原)を用いた実験を行い、HBs抗原に特異的Bリンパ球を同定し、HBs抗原に特異的な抗体遺伝子を取得できることを確認した。現在、システムの精度の向上を目指し研究を行っている。

The aim of this study is to analyze the immune disorders in patients with immune disorders by using RT-PCR amplification of their antibody genes. The cell culture method is independent and regular. The cell culture method is independent and independent. The cell culture method is regular and regular. The cell culture method is regular. The cell culture method The activation of antigen-specific molecules is regulated by light. In addition, the same time, the antigen-specific antigen receptor gene can be used to detect the antigen. This year, the following research was conducted. We have developed a new method for detecting antigen-specific B lymphocytes. The method of RT-PCR for amplification of antibody gene was established. 1. The activity of the activated cells is related to the change of intracellular concentration of the cells, the change of fluorescent pigment, and the display of fluorescent intensity of each cell on the screen. This year, the intensity of light before and after stimulation was calculated, and the number of active particles was determined. 2. The method of cell injection, natural fall and attraction are discussed. More than 95% of the cells added to the cell density were identified. The introduction of more than 80% of the cells into the medium with low cell density was confirmed by suction method. 3. In the case of hepatitis B virus, the use of hepatitis B surface antigen (HBs antigen) was investigated, and HBs antigen-specific B virus was identified and HBs antigen-specific antibody was obtained. Now, the accuracy of the system is pointed upward.

项目成果

Kondo S., et al.: "Possible involvement of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and its receptor, GFR α 1, in survival and maturation of thymocytes"Eur.J.Immunol.. 33. 2233-2240 (2003)

Kondo S. 等人：“神经胶质细胞系衍生的神经营养因子 (GDNF) 及其受体 GFR α 1 可能参与胸腺细胞的存活和成熟”Eur.J.Immunol.. 33. 2233-2240（ 2003）

Liu Q.-L., et al.: "Heat-shock protein 70 binds caspase-activated DNase and enhances its activity in TCR-stimulated T cells"Blood. 102. 1788-1796 (2003)

Liu Q.-L. 等人：“热休克蛋白 70 结合 caspase 激活的 DNase，并增强其在 TCR 刺激的 T 细胞中的活性”血液。