In vitro受精法を用いた胚発生第一分裂における極性決定の分子機構

体外受精胚胎发育第一次分裂极性决定的分子机制

基本信息

批准号：
15031222
负责人：
小柴共一
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Tokyo Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

トウモロコシの卵細胞、in vitro受精法で作製した2細胞胚、その胚から単離した頂端細胞および基部細胞からcDNAを合成し、これら4種のcDNAをテンプレートとしてRAPD-PCRを行った。その結果、受精後に新たに発現する遺伝子もしくは発現が抑制される遺伝子が同定され、それらの発現パターンから1)頂端細胞においてのみ発現する遺伝子、2)基部細胞においてのみ発現する遺伝子、3)頂端および基部細胞の双方の細胞で発現する遺伝子、4)頂端細胞においてのみ発現が抑制されている遺伝子、5)基部細胞においてのみ発現が抑制されている遺伝子、6)恒常的に発現している遺伝子、の6つのグループに分類した。さらに、受精により発現が誘導される遺伝子の発現を受精卵から2細胞胚までの受精卵発達過程で調べたところ、胚発生の第一細胞分裂以前に受精卵細胞中においてそれら遺伝子が既に発現していることが明らかになった。このことから、グループ1または2の遺伝子転写産物が受精卵中の頂端または基部領域に局在していることを示唆された。トウモロコシ卵細胞タンパク質をSDS-または2D-PAGEで展開後、ゲル中の主要タンパク質バンド/スポットをLC-MS/MSにより解析した。その結果、卵細胞主要タンパク質として、3種の解糖系酵素、2種のミトコンドリアタンパク質およびアネキシンp35を同定した。未開花のイネ花より卵細胞と精細胞をおのおの単離する系を確立し、イネin vitro受精系の確立に向けて研究を進めている。また、16個のイネ卵細胞からのcDNA合成に成功した。受精卵や2細胞胚など極微量試料からのRNAを出発材料にしてマイクロアレイ解析を行う予定であるが、このような微量のRNAをアレイ解析用のプローブ作製に用いた際のデータの信頼性を検証する研究も進行させている。

从玉米蛋细胞，通过体外受精，从胚胎分离的顶端和基底细胞产生的两细胞胚胎合成cDNA，并使用这四种类型的cDNA作为模板进行RAPD-PCR。 As a result, newly expressed genes or genes whose expression is suppressed after fertilization were identified, and based on their expression patterns, they were classified into six groups: 1) genes that are expressed only in apical cells, 2) genes that are expressed only in the base cell, 3) genes that are expressed only in the apical and base cell cells, 4) genes that are suppressed only in the apical cells, 5) genes that are suppressed only in the base cell, and 6）经常表达的基因。此外，当在从受精卵到两细胞胚胎的受精卵发育过程中检查被施肥诱导的基因的表达时，发现这些基因在胚胎发育的第一个细胞分裂之前已经在受精卵细胞中表达。这表明第1组或2组基因转录本位于受精卵中的顶端或基底区域。在使用SDS或2D页的玉米卵细胞蛋白中，通过LC-MS/MS分析了凝胶中的主要蛋白带/斑点。结果，将三种糖酵解酶，两种线粒体蛋白和膜联蛋白p35鉴定为卵细胞的主要蛋白。我们已经建立了一个系统，用于将卵细胞和精子细胞从不足的水稻花中隔离，目前正在进行研究以建立大米的体外受精系统。此外，来自16个水稻细胞的cDNA合成成功。计划使用来自极少数样品（例如受精卵和两细胞胚胎）的RNA进行微阵列分析，但是当使用少量的RNA用于准备数量的探针进行阵列分析时，也正在进行研究以验证数据的可靠性。