プロリン特異性ペプチダーゼの構造とプロリン特異性機構解明

脯氨酸特异性肽酶的结构及脯氨酸特异性机制的阐明

• 批准号: 11144231
• 负责人: 芳本 忠
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11144231/
• 关键词: プロリン; プロリルアミノペプチダーゼ; プロテアーゼ; X線結晶解析; 基質認識; プロテオリシス; 部位特異的変異

プロリンは他のアミノ酸と異なり、イミノ酸として特殊な構造をとることから多くのプロテアーゼやペプチダーゼはプロリン周辺に作用できないことが知られている。そのため、種々のプロリン特異性ペプチダーゼが存在し、多くのプロリンを持つ生理活性ペプチドやプロテオリシスに関係し代謝調節に重要な働きをしていると考えられている。本研究ではプロリン特異性酵素の中、プロリルアミノペプチダーゼの立体構造を明らかにし、更にその構造からプロリンへの選択的基質特異性の発現機構を部位特異的変異法を用いて明らかにした。酵素の活性部位は活性ドメインとヘリックスドメインの間に触媒残基(Ser,His,Asp)が存在し、その近くに疎水ポケットが存在する。この疎水ポケットの中央付近にPhe139とTyr149があることから、これらのアミノ酸をアラニンに部位特異的変異法で変えた。Phe139Alaのみ活性が低下したことからPhe139がプロリンとスタックすることで5員環を認識していることが分かった。次いで、Glu204をGlnに変えた結果、活性に大きく影響したピロリジンのアミノ基の認識に関与することが明らかになった。最後に、Arg136が基質のP1'カルボニル酸素と近い位置にあることから、このArg136をAlaに変えると、ペプチダーゼ作用はほぼ完全に消失した。しかし、アミダーゼ作用がほぼ天然の酵素と同程度残っており、ペプチドのP1'の認識に関与することを明らかにした。以上の結果から、プロリンの認識機構を初めて明らかにすることができた。

プ ロ リ ン は he の ア ミ ノ acid と different な り, イ ミ ノ acid と し て な special tectonic を と る こ と か ら more く の プ ロ テ ア ー ゼ や ペ プ チ ダ ー ゼ は プ ロ リ ン weeks 辺 に role で き な い こ と が know ら れ て い る. そ の た め, kind of 々 の プ ロ リ ン specificity ペ プ チ ダ ー ゼ が し, more く の プ ロ リ ン を hold つ physiological activity ペ プ チ ド や プ ロ テ オ リ シ ス に masato is し metabolic regulation に important な 働 き を し て い る と exam え ら れ て い る. This study で は プ ロ リ ン specificity of enzyme の, プ ロ リ ル ア ミ ノ ペ プ チ ダ ー ゼ の three-dimensional structure を Ming ら か に し, more に そ の tectonic か ら プ ロ リ ン へ の sentaku substrate specificity の 発 institutions now を を site specific - different method with い て Ming ら か に し た. Enzyme の active site は active ド メ イ ン と ヘ リ ッ ク ス ド メ イ ン の に between catalyst residue (Ser, ihs, Asp) が し, そ の nearly く に 疎 water ポ ケ ッ ト が exist す る. こ の 疎 water ポ ケ ッ ト の central pay nearly に Phe139 と Tyr149 が あ る こ と か ら, こ れ ら の ア ミ ノ acid を ア ラ ニ ン で に site specific - different method - え た. Low Phe139Ala の み active が し た こ と か ら Phe139 が プ ロ リ ン と ス タ ッ ク す る こ と で 5 member ring を know し て い る こ と が points か っ た. Time い で, Glu204 を Gln に - え た results, large active に き く influence し た ピ ロ リ ジ ン の ア ミ ノ base の know に masato and す る こ と が Ming ら か に な っ た. Final に, Arg136 が matrix の P1 'カ ル ボ ニ ル acid element position と nearly い に あ る こ と か ら, こ の Arg136 を Ala に - え る と, ペ プ チ ダ ー ゼ role は ほ ぼ に disappear completely し た. し か し, ア ミ ダ ー ゼ role が ほ ぼ natural と の enzyme with the degree of residual っ て お り, ペ プ チ ド の P1 'の know に masato and す る こ と を Ming ら か に し た. The above <s:1> results めて ら, プロリ プロリ <s:1> the <s:1> recognize the initial めて of the を institution ら ら にする にする とがで とがで た た た.

项目成果

Darbon,E.,: "Glycerol transport and phosphoenolpyruvate-dependent,enzyme I-and HPr-catalysed phosphorylation of glycerol"Microbiology. 145. 3205-3212 (1999)

Darbon,E.，：“甘油转运和磷酸烯醇丙酮酸依赖性、酶 I 和 HPr 催化的甘油磷酸化”微生物学。