アセチルコリンエステラーゼが持つペプチダーゼ作用に着目した新規阻害剤の開発

开发专注于乙酰胆碱酯酶肽酶作用的新型抑制剂

基本信息

批准号：
10877369
负责人：
芳本忠
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

最近我々は、種々のプロリン特異性ペプチダーゼの遺伝子のクローニングを行い、アセチルコリンエステラーゼと同じ、新ファミリーであることを明らかにした。アセチルコリンエステラーゼはPro-Xペプチダーゼ作用を持つことが報告されており、新しい観点からアセチルコリンエステラーゼへの阻害害剤の開発を計画した。まず、プロリン特異性ペプチダーゼの構造を調べるため、ヒト脳プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子をクローニングしその塩基配列から酵素のアミノ酸配列を明らかにした。次いで、大腸菌で発現させ酵素を精製し、ハンギングドロップ法で初めてヒト脳酵素を結晶化することに成功した。現在、X線結晶構造解析中である。また、ヒト染色体上の酵素遺伝子の場所をFISH法で調べたところ第6染色体6q13.6-q21に位置することが明らかになった。一方、同じファミリーに属するプロリルアミノペプチダーゼを結晶化し、X線結晶解析法により立体構造を明らかにした。その構造からプロリンへの選択的基質特異性の発現機構を部位特異的変異法を用いて研究した。酵素の活性部位は活性ドメインとヘリックスドメインの触媒残基(Ser,His,Asp)が存在し、その近くに疎水ポケットが存在しPhe139がプロリンとスタックすることで5員環を認識し、Glu204がピロリジンのアミノ基の認識に関与することが明らかになった。更にArg136が基質のP1'カルボニル酸素と結合して、ペプチドのP1'の認識に関与することを明らかにした。まずは、このプロリルアミノペプチダーゼの構造とアセチルコリンエステラーゼの活性部位の構造の比較検討から、新規インヒビターの開発を進めていく。

最近，我们为各种脯氨酸特异性肽酶克隆了基因，并揭示了它们与乙酰胆碱酯酶在同一家族中。据报道，乙酰胆碱酯酶具有pro-X肽酶效应，从新的角度来看，我们计划开发乙酰胆碱酯酶的抑制剂。首先，为了研究脯氨酸特异性肽酶的结构，克隆了人脑脯氨酰内肽酶基因，并从其碱基序列中揭示了酶的氨基酸序列。然后通过大肠杆菌中的表达纯化酶，并纯化酶，并使用悬挂液滴法首次成功结晶了人脑酶。当前，X射线晶体结构分析正在进行中。此外，通过FISH方法研究了酶基因在人染色体上的位置，并发现它位于6q13.6-Q21染色体。同时，属于同一家族的丙氨酸肽酶结晶，并通过X射线晶体学揭示了三维结构。使用位置定向诱变研究了从其结构到脯氨酸的选择性底物特异性表达的机理。该酶的活性部位是活性域和螺旋结构域的催化残基（Ser，His，ASP），附近有一个疏水口袋，Phe139堆栈带有脯氨酸以识别五元的环，并且已经发现GLU204参与了氨基氨基氨基氨基氨基素的识别。此外，揭示了ARG136与底物P1'Carbonyl氧结合，并参与了肽P1'的识别。首先，我们将通过比较该丙氨基肽酶的结构和乙酰胆碱酯酶活性位点的结构来发展新抑制剂。