アセチルコリンエステラーゼが持つペプチダーゼ作用に着目した新規阻害剤の開発

开发专注于乙酰胆碱酯酶肽酶作用的新型抑制剂

• 批准号: 10877369
• 负责人: 芳本 忠
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10877369/
• 关键词: アセチルコリンエステラーゼ; プロリルエンドペプチダーゼ; セリン酵素; インヒビター; プロリルアミノペプチダーゼ; X線結晶解析; プロリン; クローニング; エステラーゼ

最近我々は、種々のプロリン特異性ペプチダーゼの遺伝子のクローニングを行い、アセチルコリンエステラーゼと同じ、新ファミリーであることを明らかにした。アセチルコリンエステラーゼはPro-Xペプチダーゼ作用を持つことが報告されており、新しい観点からアセチルコリンエステラーゼへの阻害害剤の開発を計画した。まず、プロリン特異性ペプチダーゼの構造を調べるため、ヒト脳プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子をクローニングしその塩基配列から酵素のアミノ酸配列を明らかにした。次いで、大腸菌で発現させ酵素を精製し、ハンギングドロップ法で初めてヒト脳酵素を結晶化することに成功した。現在、X線結晶構造解析中である。また、ヒト染色体上の酵素遺伝子の場所をFISH法で調べたところ第6染色体6q13.6-q21に位置することが明らかになった。一方、同じファミリーに属するプロリルアミノペプチダーゼを結晶化し、X線結晶解析法により立体構造を明らかにした。その構造からプロリンへの選択的基質特異性の発現機構を部位特異的変異法を用いて研究した。酵素の活性部位は活性ドメインとヘリックスドメインの触媒残基(Ser,His,Asp)が存在し、その近くに疎水ポケットが存在しPhe139がプロリンとスタックすることで5員環を認識し、Glu204がピロリジンのアミノ基の認識に関与することが明らかになった。更にArg136が基質のP1'カルボニル酸素と結合して、ペプチドのP1'の認識に関与することを明らかにした。まずは、このプロリルアミノペプチダーゼの構造とアセチルコリンエステラーゼの活性部位の構造の比較検討から、新規インヒビターの開発を進めていく。

Recently I 々 は, kind of 々 の プ ロ リ ン specificity ペ プ チ ダ ー ゼ の posthumous son 伝 の ク ロ ー ニ ン グ を い, ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ と じ, new フ ァ ミ リ ー で あ る こ と を Ming ら か に し た. ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ は Pro - X ペ プ チ ダ ー ゼ role を hold つ こ と が report さ れ て お り, new し い 観 point か ら ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ へ の resistance against harm tonic の open 発 を project し た. ま ず, プ ロ リ ン specificity ペ プ チ ダ ー ゼ の tectonic を adjustable べ る た め, ヒ ト 脳 プ ロ リ ル エ ン ド ペ プ チ ダ ー ゼ posthumous son 伝 を ク ロ ー ニ ン グ し そ の salt base with column か ら enzyme の ア ミ ノ acid with column を Ming ら か に し た. Time い で, coliform で 発 now さ せ enzyme を refined し, ハ ン ギ ン グ ド ロ ッ プ method early で め て ヒ ト 脳 enzyme を crystallization す る こ と に successful し た. Now, in the analysis of X-ray crystallization structure, である. ま た, ヒ ト chromosome の enzyme heritage 伝 son の places を FISH method で adjustable べ た と こ ろ chromosome 6 6 q13. 6 - q21 に position す る こ と が Ming ら か に な っ た. One party, with じ フ ァ ミ リ ー に genus す る プ ロ リ ル ア ミ ノ ペ プ チ ダ ー ゼ を crystallization し, X-ray crystallization analytic method に よ り three-dimensional structure を Ming ら か に し た. Youdaoplaceholder0 <s:1> construct らプロリ らプロリ へ へ <e:1> select 択 matrix-specific <s:1> occurrence mechanism を site-specific variation method を use て て to study た. Enzyme の active site は active ド メ イ ン と ヘ リ ッ ク ス ド メ イ ン の catalyst residue (Ser, ihs, Asp) が し, そ の nearly く に 疎 water ポ ケ ッ ト が exist し Phe139 が プ ロ リ ン と ス タ ッ ク す る こ と で 5 member ring を し, Glu204 が ピ ロ リ ジ ン の ア ミ ノ base の know に masato and す る こ と が Ming Youdaoplaceholder0 になった. More に Arg136 が matrix の P1 'カ ル ボ ニ ル acid element と し て, ペ プ チ ド の P1' の know に masato and す る こ と を Ming ら か に し た. ま ず は, こ の プ ロ リ ル ア ミ ノ ペ プ チ ダ ー ゼ の tectonic と ア セ チ ル コ リ ン エ ス テ ラ ー ゼ の active site の is 検 の structure for か ら, new rules イ ン ヒ ビ タ ー の open 発 を into め て い く.

项目成果

Takahashi,E.: "Cloning of L-amino acid degrading enzyme gene from Proteus vulgaris"Bios.Biotech.Biochem.. 63・12. 2244-2247 (1999)

高桥，E.：“普通变形杆菌L-氨基酸降解酶基因的克隆”Bios.Biotech.Biochem.. 63・12 (1999)。

Kabashima.T.,: "Cloning of a novel prolidase gene from Aureobacterium esteraromaticum"Biochim.Biophys.Acta. 1429(2). 516-520 (1999)

Kabashima.T.，：“从酯芳香酸杆菌中克隆新型脯氨酸酶基因”Biochim.Biophys.Acta。

Odagaki,Y.: "The crystal structure of pyroglutamyl peptidase I from Bacillus amyloliquefaciens reveals a new structure"Structure. 7. 399-411 (1999)

Odagaki，Y.：“来自解淀粉芽孢杆菌的焦谷氨酰肽酶 I 的晶体结构揭示了一种新结构”结构。

Tanabe T.,: "Roles of the Ser 146,tyr 159,and Lys 163 Residues in the Catalytic Action of 7a-Hydroxysteroid Dehydrogenase from Escherichia coli" J.Biochem.124. 634-641 (1998)

Tanabe T.，：“Ser 146、tyr 159 和 Lys 163 残基在大肠杆菌 7a-羟基类固醇脱氢酶催化作用中的作用”J.Biochem.124。

Huang,H-S,: "Cloning,sequencing,high expressing,and crystallization of the thermophile the thermophile Thermus aquaticus Glycerol kinase" Biosci.Biotech.Biochem.62. 2375-2381 (1998)

黄海生：“嗜热菌水生栖热菌甘油激酶的克隆、测序、高表达和结晶”Biosci.Biotech.Biochem.62。