プロリン特異性ペプチダーゼの構造とプロリン特異性発現機構の解明

阐明脯氨酸特异性肽酶的结构和脯氨酸特异性表达机制

基本信息

批准号：
08278226
负责人：
芳本忠
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロリン特異性酵素のプロリンへの選択的基質特異性発現とオリゴペプチダーゼの機構を、合成基質を使った解析および結晶解析の両面から解明することを計画した。合成基質による研究は、プロリンの5員環に相当する構造を持つ合成基質や阻害剤を作り酵素化学的に研究する。一方、酵素のX線結晶解析を行いプロリン特異性酵素の立体構造を初めて明らかにすることにある。このことにより、変性タンパク質には作用できず、低分子のオリゴペプチドにのみ作用するオリゴペプチダーゼの機構や、このユニークなプロリンへの特異性の機構が明らかになり、細胞内でのペプチドやタンパク質の代謝の生理学的研究や酵素の応用に大きく貢献できると思われる。本年は、(1)プロリンイミノペプチダーゼの結晶化とX線結晶解析を開始した。沈殿剤として20%PEG6000を用い蒸気拡散法で約0.7X0.3X0.3mm^3の正八面体の結晶を得た。結晶学的解析から、空間群はP41212またはP43212格子常数a=b=65.6,c=169.8Aであり、非対称単位中に酵素が1分子含まれることが明らかとなった。(2)合成基質プロリンへの特異性を調べるため、サルコシンやN-メチルアラニンなどプロリン骨格の一部を持つ化合物についてβ-ナフチルアミド基質を合成し、プロリンへの認識部位を検討した。その結果、プロリンの5員環の各辺を認識し、基質特異性が発現していることを明らかにした。(3)更に研究は広めるため、ヒト脳由来のプロリルエンドペプチダーゼをクローニングし、塩基配列を決定した。この遺伝子を大腸菌で発現させ、菌体から酵素を単一に精製した。この酵素を現在結晶化中である。

我们计划阐明使用合成底物从分析和晶体学分析中阐明脯氨酸特异性酶对脯氨酸的选择性底物特异性表达以及寡肽酶的机制。关于合成底物的研究将创建合成底物和抑制剂，其结构与五元环相对应，并通过酶促进行研究。同时，该酶的X射线晶体学将首次阐明脯氨酸特异性酶的三维结构。这揭示了不能作用于变性蛋白的寡肽酶的机制，仅作用于小分子寡肽，以及它们对脯氨酸的独特特异性的机制，脯氨酸的独特特异性机制可能对细胞内肽和蛋白质代谢的生理研究产生显着贡献。今年，我们开始了（1）脯氨酸亚米肽酶的结晶和X射线晶体学。使用20％的PEG6000作为沉淀物，通过蒸气扩散，用约0.7 x0.3x0.3mm^3获得八面体晶体。晶体学分析表明，空间组为P41212或P43212晶格常数A = B = 65.6，C = 169.8a，并且一个酶分子包含在非对称单元中。（2）为了研究合成底物脯氨酸的特异性，将β-萘酰胺底物合成了，该化合物具有部分脯氨酸骨骼的一部分，例如肌氨酸和N-甲基丙氨酸，并检查了脯氨酸的识别位点。结果，揭示了五元环的脯氨酸环的每一侧被识别，并表达了底物特异性。（3）为了进一步拓宽研究，克隆了从人脑中的脯氨酰内肽酶，并确定了碱基序列。该基因在大肠杆菌中表达，并将酶从细胞纯化为单个纯化。该酶目前正在结晶。