プロリン特異性ペプチダーゼの構造とプロリン特異性発現機構の解明

阐明脯氨酸特异性肽酶的结构和脯氨酸特异性表达机制

• 批准号: 08278226
• 负责人: 芳本 忠
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08278226/
• 关键词: 結晶解析、; 結晶、; プロリルアミノペプチダーゼ; ペプチダーゼ; プロリン; 合成基質; 基質特異性

プロリン特異性酵素のプロリンへの選択的基質特異性発現とオリゴペプチダーゼの機構を、合成基質を使った解析および結晶解析の両面から解明することを計画した。合成基質による研究は、プロリンの5員環に相当する構造を持つ合成基質や阻害剤を作り酵素化学的に研究する。一方、酵素のX線結晶解析を行いプロリン特異性酵素の立体構造を初めて明らかにすることにある。このことにより、変性タンパク質には作用できず、低分子のオリゴペプチドにのみ作用するオリゴペプチダーゼの機構や、このユニークなプロリンへの特異性の機構が明らかになり、細胞内でのペプチドやタンパク質の代謝の生理学的研究や酵素の応用に大きく貢献できると思われる。本年は、(1)プロリンイミノペプチダーゼの結晶化とX線結晶解析を開始した。沈殿剤として20%PEG6000を用い蒸気拡散法で約0.7X0.3X0.3mm^3の正八面体の結晶を得た。結晶学的解析から、空間群はP41212またはP43212格子常数a=b=65.6,c=169.8Aであり、非対称単位中に酵素が1分子含まれることが明らかとなった。(2)合成基質プロリンへの特異性を調べるため、サルコシンやN-メチルアラニンなどプロリン骨格の一部を持つ化合物についてβ-ナフチルアミド基質を合成し、プロリンへの認識部位を検討した。その結果、プロリンの5員環の各辺を認識し、基質特異性が発現していることを明らかにした。(3)更に研究は広めるため、ヒト脳由来のプロリルエンドペプチダーゼをクローニングし、塩基配列を決定した。この遺伝子を大腸菌で発現させ、菌体から酵素を単一に精製した。この酵素を現在結晶化中である。

Substrate-specific discovery of selected enzymes, analysis of synthetic substrates, and analysis of crystalline substrates are planned. Study of synthetic substrates, their 5-membered ring equivalents, and their structural and enzyme chemical properties X-ray crystallographic analysis of a single enzyme The mechanism for the mechanism of low molecular weight, high molecular weight, and high molecular weight in the study of metabolism and physiology of intracellular proteins and enzymes is discussed. This year, the crystallization and X-ray crystallization analysis of the film began. The crystal of PEG6000 was obtained by evaporation and dispersion method, and the crystal was about 0.7X0.3X0.3mm^3. Crystallographic analysis of space group P41212 lattice constant a=b=65.6,c=169.8A, non-symmetric unit of enzyme 1 molecule contains (2)A part of the matrix of synthetic compounds is synthesized and studied. The results show that the five rings of the protein are recognized, and the matrix specificity is revealed. (3)In addition, the study of the origin of the selection process, the selection process, the selection process The bacteria are isolated from E. coli, and the bacteria are purified from enzymes. The enzyme is now crystallized.

项目成果

Tanaka,N.et al.: "Crystal structures of the binary and ternary complexes of 7α-hydroxysteroid dehydrogenase from Escherichia coli" Biochemistry. 35. 7715-7730 (1996)

Tanaka, N. 等人：“大肠杆菌 7α-羟基类固醇脱氢酶的二元和三元复合物的晶体结构”，生物化学 35. 7715-7730 (1996)。

Kakimori,T. et al.: "Nucleotide sequence of the gene encoding pepstatin-insensitive acid protease B, Scytalidopepsin B,of Seytalidium lignicolum" Biosci. Biotech. Biochem.,. 60. 1210-1211 (1996)

卡基森，T.

Kabashima,T.et al.: "Dipeptidyl peptidase IV from Xthantomonas maltophilia:" J.Biochem.120. 1111-1117 (1996)

Kabashima，T.et al.：“来自嗜麦芽单胞菌的二肽基肽酶 IV：”J.Biochem.120。

Tanaka,N.et al.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of 7α-hydroxysteroid dehydrogenase from Escherichia coli" Acta Crystallographica D. 52. 215-217 (1996)

Tanaka, N. 等人：“大肠杆菌 7α-羟基类固醇脱氢酶的结晶和初步 X 射线晶体学研究”Acta Crystallographa D. 52. 215-217 (1996)

Kitazono,A.et al.: "Prolyl aminopeptidase is also present in Enterobacteriaceae : Cloning and sequencing of the Hafnia alvel enzyme-gene" J.Biochiem.119. 468-474 (1996)

Kitazono,A.等人：“脯氨酰氨肽酶也存在于肠杆菌科中：Hafnia alvel 酶基因的克隆和测序”J.Biochiem.119。