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無細胞たんぱく合成系でのチトクロム酸化酵素の機能発現: 人工アミノ酸の部位特異的導入法を利用したプロトン能動輸送機構の解析を目指して

无细胞蛋白质合成系统中细胞色素氧化酶的功能表达：旨在通过位点特异性引入人工氨基酸来分析质子主动转运机制

基本信息

批准号：
09878148
负责人：
島田秀夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

シトクロム酸化酵素のプロトン輸送機構を解明するため、その解析方法として安定同位体ラベルのアミノ酸を部位特異的に導入し、酸素の還元反応にともなうアミノ酸残基の変化を振動分光法で直接観察することを計画した。この導入は無細胞たんぱく合成系を使用するため、本研究では、酵素の機能発現システムの構築を以下のように試みた。Paracoccus denitrificansのシトクロム酸化酵素のサブユニットIβ、II、III遺伝子をPCR法でクローニングし、それぞれの塩基配列を確認後、プラスミドpUC18のlacプロモーターの下流にIβ、II、IIIの順に挿入し発現ベクターを構築した。なおIβのC末端にHis-Tagを挿入した。このベクターを用い、大腸菌内で本酵素の発現を試み、発現の有無をWestern blot法で解析した。Blot解析に用いた抗体は、精製酵素標品(姫路工大、吉川教授より分与された)をウサギに接種して得た。今回用いた精製標品はIβ、IIのみを含む。従って得られた抗体はIβ、IIに対するものなので、この方法ではIIIは検出されない。大腸菌の膜画分から、dodecylmaltosideで可溶化された分画を、Ni-NTAカラムを用いて部分精製し、Blot法で部分精製標品が、Iβ、IIたんぱくを含むことを確認した。次に大腸菌の無細胞たんぱく合成系を用い、^<35>S-methionineの取り込みで発現を検討したところ、Iβ、II、IIIに一致するサイズのたんぱくがベクターに依存して検出された。従って無細胞系での発現が示された。またラット膵臓の膜画分あるいはphosphatidylcholineからなるリポソームを添加し発現量が5倍に上昇することを見出した。発現量はほぼ充分なので、今後はヘムを外部から加え、リポソームへの機能発現を試みる。以上の成果は、本年度の日本生物物理学会で発表した。

STOCK Acidifying Enzyme のプロトン Transport Mechanism を Explained するため, その Analysis Method として Stable Isotope ラベルのアミノ Acid を Department The specific introduction and reduction of acid residues and the transformation of acid residues were directly observed by vibrational spectrometry and planned to be carried out. The introduction of the cell-free synthetic system, the use of this research, the function of the enzyme, and the construction of the following enzymes were tested. Paracoccus denitrificans のシトクロムacidifying enzyme のサブユニットIβ, II, III 缝子をPCR method でクローニングし, それぞれAfter confirming the base arrangement, the プラスミドpUC18のlacプロモーターの流にIβ, II, and III のcisに were inserted into the ベクターをconstructed した.なおIβのC-terminal His-Tagをinsertした. The use of this enzyme, the enzyme present in the coliform bacteria, the presence or absence of the enzyme in coliform bacteria, and the analysis of the Western blot method. Blot analysis was carried out using antibodies and purified enzyme standards (Professor Yoshikawa Yoshikawa of Himeji University of Technology) and inoculation with Yoshino. This time I will use the refined standard products はIβ and II のみをcontaining む.従って got られたantibodyはIβ, IIに対するものなので, この法ではIIIは検出されない. Coliform membrane painting points, dodecylmaltoside solubilization, Ni-NTA カラムを is partially purified using the Blot method, and the standard is partially purified using the Blot method. Subcoli's cell-free synthetic system is used, and ^<35>S-methionine is taken out of the cell-free synthetic system.検取したところ、Iβ、II、IIIに unanimous するサイズのたんぱくがベクターにdependence して検出された.従ってThe cell line-free system is now showing itself. Phosphatidylcholin eからなるリポソームをaddし発existing amountが5 timesにriseすることを见出した. The actual amount of the problem is sufficient, the future is the external part, and the function of the function is good. The above results are listed in this year's list of the Japanese Biophysical Society.