無細胞たんぱく合成系でのチトクロム酸化酵素の機能発現: 人工アミノ酸の部位特異的導入法を利用したプロトン能動輸送機構の解析を目指して

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シトクロム酸化酵素のプロトン輸送機構を解明するため、その解析方法として安定同位体ラベルのアミノ酸を部位特異的に導入し、酸素の還元反応にともなうアミノ酸残基の変化を振動分光法で直接観察することを計画した。この導入は無細胞たんぱく合成系を使用するため、本研究では、酵素の機能発現システムの構築を以下のように試みた。Paracoccus denitrificansのシトクロム酸化酵素のサブユニットIβ、II、III遺伝子をPCR法でクローニングし、それぞれの塩基配列を確認後、プラスミドpUC18のlacプロモーターの下流にIβ、II、IIIの順に挿入し発現ベクターを構築した。なおIβのC末端にHis-Tagを挿入した。このベクターを用い、大腸菌内で本酵素の発現を試み、発現の有無をWestern blot法で解析した。Blot解析に用いた抗体は、精製酵素標品(姫路工大、吉川教授より分与された)をウサギに接種して得た。今回用いた精製標品はIβ、IIのみを含む。従って得られた抗体はIβ、IIに対するものなので、この方法ではIIIは検出されない。大腸菌の膜画分から、dodecylmaltosideで可溶化された分画を、Ni-NTAカラムを用いて部分精製し、Blot法で部分精製標品が、Iβ、IIたんぱくを含むことを確認した。次に大腸菌の無細胞たんぱく合成系を用い、^<35>S-methionineの取り込みで発現を検討したところ、Iβ、II、IIIに一致するサイズのたんぱくがベクターに依存して検出された。従って無細胞系での発現が示された。またラット膵臓の膜画分あるいはphosphatidylcholineからなるリポソームを添加し発現量が5倍に上昇することを見出した。発現量はほぼ充分なので、今後はヘムを外部から加え、リポソームへの機能発現を試みる。以上の成果は、本年度の日本生物物理学会で発表した。