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カムオペロンの末端酸化酵素と電子供与体たんぱく質の複合体

凸轮操纵子末端氧化酶和电子供体蛋白复合物

基本信息

批准号：
13033036
负责人：
島田秀夫
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

カンファー水酸化反応は、基質カンファーが酸化型P450camに結合することから始まる。この結合によって、酵素の酸化還元電位が上昇し、その結果、電子供与体プチダレドキシン(Pdx)によって還元される。したがって、両たんぱく質の相互作用は、もっぱら基質存在下で研究された。今回、複合体形成における基質の役割を、還元型PdxのEPRシグナルをプローブとして検討した。基質はP450camとPdxの複合体形成そのものに有意な影響を与えないものの、基質結合が、Pdx結合部位構造を変え、これまで知られていた活性部位構造の変化に加え、その変化がP450cam分子表面にまで及ぶことが初めて明らかになった。P450の触媒反応には、2等量の水素イオンが必須であるが、どのように水素イオンが酵素内部の活性部位に供給されるのかまだよく解明されていない。昨年P450camの水素イオン取り込み口となるアミノ酸残基、Asp182を見出した。2,3の膜タンパク質で、水素イオンの取り込み口に結合して、水素イオンの取り込みを阻害することが知られているZn2+の効果をP450camで検討した結果、2mMのZn2+で、活性が約50%に低下することがわかった。また1mMのZn2+で、酸化型P450camの吸収スペクトルに変化が見られ、活性部位構造の変化が示された。しかし、吸収スペクトルの変化と活性阻害の関連、またZn2+結合部位は今後の検討課題として残った。水素イオンが、酵素に取り込まれてAsp182に近接したAsp251に渡り、ヘム鉄に結合した酸素分子に供給される過程に、Asp251とThr252の間のペプチド結合を介した水素イオン輸送が介在する可能性を検討するため、Thr252をプロリンに変え、水素イオンの輸送を困難にすることを考えた。そこで、Thr252をProに置換した変異酵素を大腸菌で発現させ、SDS-PAGEで単一のバンドにまで精製した。基質カンファーが結合した酸化型変異酵素は、野生型と異なり、完全な高スピン型にならず、低スピン型が大部分を占めた。還元型、一酸化炭素化型の光吸収スペクトルは、野生型と変わらなかったが、分子吸光係数は、有意に変化した。また変異酵素の活性は、野生型の15%に低下したことから、変異によって活性部位構造および酵素機能に変化が起きたことが示された。しかし、活性の低下は、どの部分反応の低下なのか、まだ不明で、今後検討すべき課題である。

Acidification of P450cam in aqueous phase, matrix phase and matrix phase The binding enzyme, the enzyme's acidification potential increases, and the electron donor (Pdx), the enzyme's acidification potential increases. The interaction between the two substances was studied in the presence of a matrix. In the present case, the matrix of complex formation is divided into two parts, and the EPR of reductive Pdx is divided into two parts. The formation of P450cam and Pdx complex is affected by the change of structure of Pdx binding site, the change of structure of active site, and the change of surface of P450cam molecule. P450 catalyst reaction, 2 equal amount of water element, water element, enzyme internal active site, water element, enzyme internal active site, enzyme internal active site. The P450cam protein was found in the presence of the amino acid residue Asp182. 2, 3, 2 mM Zn2 +, 2 mM Zn2 +, 2mM Zn2 mM Zn 1mM Zn2 +, acid-type P450cam absorption characteristics, active site structure characteristics The relationship between absorption and activity resistance, and the binding site of Zn2+ are the problems to be discussed in the future Asp182, Asp 251, Asp 252, Asp 252, Asp251, Asp 252, Asp 252, Asp251, Asp 252, Asp 252, Asp251, Asp 252, Asp251, Asp 252, Asp 252, Asp 251, Asp 252, Asp 252, Asp 251, Asp 252, Asp 252, Asp 251, Asp 252, Asp 25 Thr252 is a protein that can be purified by SDS-PAGE. The matrix is composed of two different types of enzymes: wild type, high type and low type. The absorption coefficient of the original type, the acidified carbon type, the wild type, the molecular absorption coefficient, and the intentional change. 15% lower than wild-type in enzyme activity and 15% lower in enzyme function. Low activity, low partial reaction, unknown, future research topics