生体内増幅アンチセンスRNAを用いる脳機能解析法の開発

开发使用体内扩增反义RNA的脑功能分析方法

• 批准号: 09878176
• 负责人: 安原 治
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Shiga University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09878176/
• 关键词: アンチセンスRNA; RNAポリメラーゼ; 脳機能解析法; バゾプレッシン; T7プロモーター; cRNA増幅法; ホスホロチオエート・オリゴ; ポリチミジン・オリゴヌクレオチド; バゾブレッシン; ホスホロチオエ-トオリゴ; ポリチミジン・オリゴヌクレオテド; CRNA増幅法

本研究の目的は生体の脳内局所においてアンチセンスRNAを増幅させることにより、その脳局所機能を一時的に停止させ、当該脳領域の機能解析を実現することにある。まず、溶液中でのRNAポリメラーゼ増幅反応によるcRNAの増幅を確認した後、バゾプレッシン特異的配列に対するホスホロチオエート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドを脳内投与し、バゾプレッシン機能を抑制しうる有望な配列を見いだした。この配列を用いて逆転写酵素およびジゴキシゲニン標識dUTPを含むヌクレオチド基質と共にラットの室傍核に微量投与し、一本鎖cDNAの生成条件を検討した。ラットをかん流固定し、取り出した脳からクリオスタット切片を作製し、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて免疫組織化学的に検索した。投与・反応条件の検討によって、一部の神経細胞に淡い染色が観察された。しかし、神経細胞による非特異的な取り込みである可能性を否定できず、さらに検討を重ねる必要がある。一方、より高感度のin situ mRNA検出法確立の目的で、固定切片上でのRNAポリメラーゼ増幅反応法の条件について検討を開始した。各反応ステップについて、至適反応条件を決定すべく検討を続行中である。特異的なmRNAに対するアンチセンスRNAを固定切片上で増幅し、それをセンス・プローブを用いたin situ hybridization法で検出することにより、mRNAの検出感度が飛躍的に増大するものと期待される。

The purpose of this study is to increase the amplitude of RNA in the internal organs of organisms, to stop the function of these organs, and to realize the function analysis of these organs. After confirmation of the increase in the amplitude of cRNA in solution, the specific alignment of cRNA in solution is expected to be achieved. This sequence was characterized by reverse transcription of enzymes and DNA markers, and by micro-injection of DNA into the DNA of the host cells. The tissue sections were prepared and anti-tumor antibodies were detected by immunohistochemistry. A part of the nervous system cells were stained with light. The possibility of non-specific selection of neurons is denied, and the necessity of re-selection is discussed. To establish the purpose of high sensitivity in situ mRNA detection method, the conditions for RNA amplification and amplification in fixed sections were discussed. The conditions for each reaction are determined by the reaction conditions. The sensitivity of specific mRNA to RNA was increased on fixed sections and expected to increase by a large margin using situ hybridization.