生体内増幅アンチセンスRNAを用いる脳機能解析法の開発

本研究の目的は生体の脳内局所においてアンチセンスRNAを増幅させることにより、その脳局所機能を一時的に停止させ、当該脳領域の機能解析を実現することにある。まず、溶液中でのRNAポリメラーゼ増幅反応によるcRNAの増幅を確認した後、バゾプレッシン特異的配列に対するホスホロチオエート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドを脳内投与し、バゾプレッシン機能を抑制しうる有望な配列を見いだした。この配列を用いて逆転写酵素およびジゴキシゲニン標識dUTPを含むヌクレオチド基質と共にラットの室傍核に微量投与し、一本鎖cDNAの生成条件を検討した。ラットをかん流固定し、取り出した脳からクリオスタット切片を作製し、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて免疫組織化学的に検索した。投与・反応条件の検討によって、一部の神経細胞に淡い染色が観察された。しかし、神経細胞による非特異的な取り込みである可能性を否定できず、さらに検討を重ねる必要がある。一方、より高感度のin situ mRNA検出法確立の目的で、固定切片上でのRNAポリメラーゼ増幅反応法の条件について検討を開始した。各反応ステップについて、至適反応条件を決定すべく検討を続行中である。特異的なmRNAに対するアンチセンスRNAを固定切片上で増幅し、それをセンス・プローブを用いたin situ hybridization法で検出することにより、mRNAの検出感度が飛躍的に増大するものと期待される。

本研究の目的は生体の脳内局所においてアンチセンスRNAを増幅させることにより、その脳局所機能を一時的に停止させ、当該脳領域の機能解析を実現することにある。まず、溶液中でのRNAポリメラーゼ増幅反応によるcRNAの増幅を確認した後、バゾプレッシン特異的配列に対するホスホロチオエート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドを脳内投与し、バゾプレッシン機能を抑制しうる有望な配列を見いだした。この配列を用いて逆転写酵素およびジゴキシゲニン標識dUTPを含むヌクレオチド基質と共にラットの室傍核に微量投与し、一本鎖cDNAの生成条件を検討した。ラットをかん流固定し、取り出した脳からクリオスタット切片を作製し、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて免疫組織化学的に検索した。投与・反応条件の検討によって、一部の神経細胞に淡い染色が観察された。しかし、神経細胞による非特異的な取り込みである可能性を否定できず、さらに検討を重ねる必要がある。一方、より高感度のin situ mRNA検出法確立の目的で、固定切片上でのRNAポリメラーゼ増幅反応法の条件について検討を開始した。各反応ステップについて、至適反応条件を決定すべく検討を続行中である。特異的なmRNAに対するアンチセンスRNAを固定切片上で増幅し、それをセンス・プローブを用いたin situ hybridization法で検出することにより、mRNAの検出感度が飛躍的に増大するものと期待される。