精細管再構成によるin vitro精子形成法の開発

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1.Germline stem cell及びieSC(induced embryonic Sertoli cells)、MSC (Mesenchymal Stem cells)の樹立：C57BL6/Tg14(act-EGFP-OsbY01)を購入し、DBA/1Jマウスと交配させ、第一世代のmale pup(日齢１－３)の精巣よりGFP発現GS細胞株を樹立した。MEF(マウス胎児由来繊維芽細胞)を交配後13.5日の妊娠マウス（CBA/J）より樹立し、ieSC作成に不可欠な5因子の遺伝子群（Wt1, Dmrt1, Nr5a, Gata4, Sox9）をレンチウイルス感染により導入した。その後ピューロマイシンによる薬剤選択を行ったのち、クローニングを行った。24 colonyを取り、それぞれの導入遺伝子の発現を確認した。導入遺伝子の発現レベルは個々により非常に大きな差が見られた。その中で比較的発現の高いコロニーを3つ選び出した。これらは非常に高い増殖能を持ち、GDNFとFGFもMEFに比べて亢進しているという点でembryonic Sertoli cellの特長に類似していた。またadultマウスの側腹部の脂肪組織よりMSCを分離・培養を行った。2.ieSCとGS細胞の共培養：GS細胞の培養にはFeeder cellとFGFとGDNFの添加が必須である。FGF・GDNFの発現をしているieSCをfeederとして培養が可能かどうかを検討した。ieSCをfeederとしてサイトカインなしでGS細胞と共培養を行った。通常GS細胞は増殖をすることができず死滅するが、ieSCをfeederとして使用すると、増殖までは認めなかったが、GS細胞の維持期間がやや延長した。3.ieSCsを中心としたin vitroの精細管再構成の検討：Satoらが構築したin vitroの精細管再構成法を参考にして、アガロース上にてieSC、MSC、GS細胞の混合したものを培養した。様々な培養条件を検討したが、明らかな精細管の再構成は認められなかった。またGFPを発現するGS細胞も維持できていないことが分かった。