精細管再構成によるin vitro精子形成法の開発

开发利用曲细精管重建的体外精子发生方法

• 批准号: 26713049
• 负责人: 奥田 英伸
• 金额: $ 3.33万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-01 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-26713049/
• 关键词: Sertoli-like cells; レンチウイルス; Germline stem cells; 精子形成; セルトリ細胞; 遺伝子導入

1.Germline stem cell及びieSC(induced embryonic Sertoli cells)、MSC (Mesenchymal Stem cells)の樹立：C57BL6/Tg14(act-EGFP-OsbY01)を購入し、DBA/1Jマウスと交配させ、第一世代のmale pup(日齢１－３)の精巣よりGFP発現GS細胞株を樹立した。MEF(マウス胎児由来繊維芽細胞)を交配後13.5日の妊娠マウス（CBA/J）より樹立し、ieSC作成に不可欠な5因子の遺伝子群（Wt1, Dmrt1, Nr5a, Gata4, Sox9）をレンチウイルス感染により導入した。その後ピューロマイシンによる薬剤選択を行ったのち、クローニングを行った。24 colonyを取り、それぞれの導入遺伝子の発現を確認した。導入遺伝子の発現レベルは個々により非常に大きな差が見られた。その中で比較的発現の高いコロニーを3つ選び出した。これらは非常に高い増殖能を持ち、GDNFとFGFもMEFに比べて亢進しているという点でembryonic Sertoli cellの特長に類似していた。またadultマウスの側腹部の脂肪組織よりMSCを分離・培養を行った。2.ieSCとGS細胞の共培養：GS細胞の培養にはFeeder cellとFGFとGDNFの添加が必須である。FGF・GDNFの発現をしているieSCをfeederとして培養が可能かどうかを検討した。ieSCをfeederとしてサイトカインなしでGS細胞と共培養を行った。通常GS細胞は増殖をすることができず死滅するが、ieSCをfeederとして使用すると、増殖までは認めなかったが、GS細胞の維持期間がやや延長した。3.ieSCsを中心としたin vitroの精細管再構成の検討：Satoらが構築したin vitroの精細管再構成法を参考にして、アガロース上にてieSC、MSC、GS細胞の混合したものを培養した。様々な培養条件を検討したが、明らかな精細管の再構成は認められなかった。またGFPを発現するGS細胞も維持できていないことが分かった。

1. Germline stem cells and ieSC(induced embryonic Sertoli cells), MSC (Mesenchymal Stem cells) were established: C57BL6/Tg14 (act-EGFP-OsbY01) was purchased, DBA/1J was mated, and the first generation of male pup(day 1-3) was established. MEF(fetal origin) was established on day 13.5 of gestation (CBA/J), iESC was constructed, and five genetic subgroups (Wt1, Dmrt1, Nr5a, Gata4, Sox9) were introduced.その后ピューロマイシンによる薬剤选択を行ったのち、クローニングを行った。24 colony selection, identification of the presence of the introduced gene The introduction of the gene to the development of a very large number of different In the middle of the comparison, there is a high level of competition. This is a very high level of reproductive activity, and GDNF and FGF are very similar to embryonic Sertoli cells. Adult and subcutaneous fat cells were isolated and cultured 2. Co-culture of iESC and GS cells: The addition of Feeder cell, FGF and GDNF is necessary for GS cell culture. FGF-GDNF development and development of iESC ieSC feeder and GS co-culture GS cells usually grow and die, iESC feeds and uses, and GS cells maintain for longer periods. 3. Study on fine tube reconstruction of iESCs in vitro: Sato's construction of fine tube reconstruction method in vitro is a reference method for mixed culture of iESCs, MSCs and GS. The culture conditions were discussed, and the fine tube was reconstructed. The expression of GFP in GS cells is maintained.

项目成果

“A novel transcription factor NKAPL is a germ cell-specific suppressor of the Notch signaling pathway and is indispensable for spermatogenesis”

“一种新型转录因子 NKAPL 是 Notch 信号通路的生殖细胞特异性抑制剂，对于精子发生是不可或缺的”

• 发表时间: 2015
• 作者: 木村奈緒;仲上豪二朗;峰松健夫;真田弘美;Hidenobu Okuda
• 通讯作者: Hidenobu Okuda

LRGUK-1 is required for basal body and manchette function during spermatogenesis and male fertility.

• DOI: 10.1371/journal.pgen.1005090
• 发表时间: 2015-03
• 期刊: PLoS genetics
• 影响因子: 4.5
• 作者: Liu Y;DeBoer K;de Kretser DM;O'Donnell L;O'Connor AE;Merriner DJ;Okuda H;Whittle B;Jans DA;Efthymiadis A;McLachlan RI;Ormandy CJ;Goodnow CC;Jamsai D;O'Bryan MK
• 通讯作者: O'Bryan MK

A novel transcriptional factor Nkapl is a germ cell-specific suppressor of Notch signaling and is indispensable for spermatogenesis.

• DOI: 10.1371/journal.pone.0124293
• 发表时间: 2015
• 期刊: PloS one
• 影响因子: 3.7
• 作者: Okuda H;Kiuchi H;Takao T;Miyagawa Y;Tsujimura A;Nonomura N;Miyata H;Okabe M;Ikawa M;Kawakami Y;Goshima N;Wada M;Tanaka H
• 通讯作者: Tanaka H