权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

脱ユビキチン化酵素の切断モチーフを利用したタンパク質発現制御法の開発とその応用

去泛素化酶剪切基序蛋白表达控制方法的建立及其应用

基本信息

批准号：
22KJ0416
负责人：
宇津木優樹
金额：
$ 1.09万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0416/
关键词：
デグロン脱ユビキチン化酵素ユビキチン

项目摘要

本研究では、デグロンと標的タンパク質の間に、細胞内の脱ユビキチン化酵素によって切断される基質配列を挿入することで、低分子化合物を添加し、デグロン融合タンパク質が安定化された後、細胞内の脱ユビキチン化酵素の活性により、標的タンパク質からデグロンを切り離すシステムを構築する。発現制御法としての基本的性能を明らかにするとともに、ゲノム編集技術を用いて、内在性タンパク質の発現制御への適用を目指す。令和４年度は、本デグロンシステムにより、内在的に発現するタンパク質の存在量を制御することが可能であるかを検討するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術を用いて、標的タンパク質ｃ－ＳｒｃのＮ末端にデグロンおよび切断基質配列を挿入した。Ｐ２Ａ配列上流に接続したｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子と、デグロンおよび切断基質配列を標的領域に相同な配列で挟んだ遺伝子を含むドナープラスミドを、標的遺伝子に対するガイドＲＮＡの鋳型となる遺伝子配列を含んだＣａｓ９発現ベクターとともに、ヒト１倍体細胞であるＨＡＰ１細胞に遺伝子導入した。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる導入細胞の薬剤選択後、シングルセルクローニングを行い、ＰＣＲによるジェノタイピングにより、ノックインを確認した。さらに、ウエスタンブロットにより、デグロンと切断基質配列を付加した内在性ｃ－Ｓｒｃが、化合物添加時に、安定化され、ｃ－Ｓｒｃからデグロンが切り離されることを確認した。

In this study, we constructed a matrix alignment system for the separation of target enzymes from substrates, the addition of low molecular weight compounds, and the stabilization of target enzymes from substrates. The basic performance of the development control method is clearly stated, and the compilation technology is used, and the inherent quality of the development control method is indicated. In 2010 and 2014, CRISPR/Cas9 was introduced into the application of CRISPR/Cas9 compilation technology, the N-terminal of CRISPR/Cas9, and the N-terminal of CRISPR/Cas9. P2A alignment upstream of puromycin resistant gene, protein, and substrate alignment target domain in the same alignment, including RNA type, protein alignment, including Cas9 development, protein introduction into HAP1 cells. After the selection of Puromycin, the selection of puromycin, puromycin and puromycin was confirmed. In addition, the intrinsic c-Src property of the matrix was confirmed when the compound was added, and the stability of the matrix was confirmed.

项目成果

期刊论文数量（3）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Rapid and tunable drug control of protein levels in native or near-native form

对天然或接近天然形式的蛋白质水平进行快速且可调节的药物控制

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
小松一彦;小野田誠;熊谷政仁;小林広明;Yuki Utsugi and Yusaku Miyamae;Yuki Utsugi and Yusaku Miyamae
通讯作者：
Yuki Utsugi and Yusaku Miyamae

An excisable degron system for conditional control of protein stability without loss-of-function

一种可切除的降解决定子系统，用于在不丧失功能的情况下条件控制蛋白质稳定性

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
小松一彦;小野田誠;熊谷政仁;小林広明;Yuki Utsugi and Yusaku Miyamae
通讯作者：
Yuki Utsugi and Yusaku Miyamae

A method for conditional control of cellular protein stability using an excisable degron tag

使用可切除降解决定子标签条件控制细胞蛋白质稳定性的方法

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
小松一彦;小野田誠;熊谷政仁;小林広明;Yuki Utsugi and Yusaku Miyamae;Yuki Utsugi and Yusaku Miyamae;Yuki Utsugi and Yusaku Miyamae
通讯作者：
Yuki Utsugi and Yusaku Miyamae