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DNA自己増幅ループを用いたスクリーニング不要のin vitro分子進化法の開発

开发无需使用 DNA 自扩增环进行筛选的体外分子进化方法

基本信息

批准号：
22K14794
负责人：
古林太郎
金额：
$ 2.91万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、進化的な手法を用いて有用な物質を進化させる「指向性進化(Directed Evolution)」の分野において、革新的なin vitro進化系を立ち上げることを目指した研究である。これまでに多様な指向性進化の手法が開発されてきたが、これらは大腸菌や酵母などの生物を用いるin vivoアプローチと、生物を用いないin vitroアプローチに大別される。前者はホスト生物を生きたまま利用するため進化ターゲットや反応条件が制限され、また後者には生物の高度な能力(複雑な反応制御や自己複製)を利用できないことにより単純な機能しか進化できない・煩雑なスクリーニング作業が必要などの欠点があった。私は酵素活性を自己複製にカップリングさせることにより、機能の高い変異体をスクリーニングなしに自律進化させる系の構築を試みている。この手法により、従来は各ステップごとに人為的な介入が必要であった変異導入・機能発現・選択・増幅の過程をワンポットの等温反応に統合し、スクリーニング過程の排除のみならず進化サイクル全体を劇的に効率化することを目指している。初年度はT3RNAPポリメラーゼをモデル酵素とし、その酵素活性(転写能力)が自らの遺伝子(DNA)の自己増幅へと変換される分子装置、および反応系を進化させるための微小進化リアクターの検討(w/oエマルションを用いる)を行い、進化実験のための基盤を整えた。この反応系が実際に進化に使えるかを2年目に検討する。この研究が成功すれば、進化工学に「簡便で誰でも使える、高効率である、多種の酵素が進化できる」を満たす初めてのin vitro分子進化系がもたらされ、数多くの有用酵素を生み出す重要なプラットフォームになると考えられる。

In this study, the methods of evolution are used to study the evolution of useful substances, and the division of "Directed Evolution" is used to study the innovation of vitro evolution. The method of multi-directional evolution was developed in vivo, in vitro and in vivo for Escherichia coli and yeast. The former is the biological evolution of the condition to limit, the latter is the biological high ability (complex control and self-replication) to use, the pure function of evolution of the condition to limit, the lack of work. The activity of the enzyme is self-replicating, and the function of the enzyme is highly variable. This method is based on the necessity of artificial intervention, the introduction of different functions, the selection and amplification of the process, the isothermal inverse integration, the elimination of the process, the evolution of the process, and the efficiency of the whole process. In the early years, T3RNAP molecules were transformed into molecular devices, reaction systems, and micro-evolution. This is a two-year study. This research has been successful in evolutionary engineering. It is easy to use, high efficiency, and a variety of enzymes to evolve.