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電位依存性カルシウムチャンネルの分子レベルでの研究

分子水平电压门控钙通道研究

基本信息

批准号：
61215019
负责人：
福井裕行
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ニトレンジピンをはじめとするジヒドロピリジン・カルシウム拮抗薬が阻害する電位依存性カルシウムチャンネルは骨格筋型,心筋型,脳型の三種のサブタイプの存在が予想されている。我々は[【^3H】]ニトレンジピン結合活性を指標にラット脳より同ラジオアイソトープリガンドに対する受容体(電位依存性カルシウムチャンネル)の可溶化に成功した。可溶化はラット脳シナプス膜分画を材料とし、界面活性剤(CHAPS,Brij58,Lubrol WX)及びグリセリンを含むトリス緩衝液を用いた。ホモゲナイズと超音波処理後、100K×g遠心により可溶化受容体は上清に回収された。CHAPSの至適濃度は10mM、グリセリンは20%(w/v)以上を必要とした。CHAPSのみによる"可溶化受容体"は分子量が非常に大きく、膜小片を多く含むことが考えられ、0.25%(w/v)Brij58及び0.025%(w/v)Lubrol WXを加えることにより完全に可溶化された。可溶化受容体の分子量はゲル濾過及び庶糖密度勾配遠心により、それぞれ、180K及び80Kであった。可溶体受容化の〔【^3H】]ニトレンジピンに対する親和性(【K_D】)は5.8nMであり、膜に組み込まれたものより約10倍親和性が低下した。可溶化受容体は非ジヒドロピリジン・カルシウム拮抗薬であるベラパミル,プレラミンによって[【^3H】]ニトレンジピンとの結合が阻害された。ベラパミルは[【^3H】]ニトレンジピン結合を100%阻害するのに対して、プレニラミンの最大阻害度は70%であった。両者共に50%阻害濃度(【IC_(50)】)は100nMであった。ウサギ骨格筋Tチュブルの同受容体の可溶化条件(10mM CHAPS及び20%(w/v)グリセリン)を用いラット脳[【^3H】]ニトレンジピン受容体を"可溶化"すると上述の如く膜小片で多く含んだ状態である上に、[【^3H】]ニトレンジピン結合活性の半減期は1.5日であった。我々の条件による可溶化では活性の半減期は8.5日であり、安定性が約6倍増加した。

The potential dependence of the resistance of the three types of receptors is expected to exist in the three types of receptors: skeletal, cardiac, and skeletal. The solubility of the receptor (potential-dependent receptor) was successfully determined by [^3H]. Soluble surfactants (CHAPS,Brij58,Lubrol WX) and surfactants containing surfactants are used. After ultrasonic treatment, 100K×g telecentric solubilized receptor and supernatant were recovered. The optimum CHAPS concentration is 10mM, and the concentration of CHAPS is 20%(w/v) or more. CHAPS has a molecular weight of 0.25%(w/v)Brij58 and a molecular weight of 0.025%(w/v)Lubrol WX. The molecular weight of the soluble receptor varies from 180K to 80K. Soluble receptor affinity (K_D) is 5.8 nM, membrane affinity is about 10 fold lower. Soluble receptor is not a natural receptor, but a natural receptor antagonist. The maximum resistance of the system is 70% when the system is combined with 100% resistance. 50% inhibitory concentration (IC50) was found in all samples. The solubilization conditions (10mM CHAPS and 20%(w/v) gelatine) for the co-receptor of the T-cell membrane can be used to "solubilize" the [^3H]] N-cell membrane receptor. In addition to the above-mentioned multi-component state of the membrane sheet, the half-life of the [^3H] N-cell membrane binding activity is 1.5 days. Under these conditions, the solubility and activity half-life increased by 8.5 days and the stability increased by about 6 times.