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インサイツハイブリダイゼーション法による造血器細胞の遺伝子発現に関する研究

原位杂交方法研究造血细胞基因表达

基本信息

批准号：
62570541
负责人：
北堅吉
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Mie University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1987
资助国家：
日本
起止时间：
1987 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

造血器細胞の分子生物学的研究は大量の細胞を必要とするSouthen法やNorthern法で行われており, 細胞形態や免疫学的方法による個々の細胞レベルでの成果との比較検討には一定の限界がある. 本研究では個々の細胞レベルでの遺伝子発現の検出が可能なin situ hybridization法の開発及びその応用を目的とした. 本法の開発は, 癌遺伝子であるmye及びfms遺伝子に対するDNA probeを用い, 分化誘導物質であるTPA添加培養でそれらの遺伝子発現が既にNorthern法で明らかにされているヒト骨髄球系細胞株HL60の系で行った. probeの標識には放射線同位元素標識法とBiotin標識法の二法があるが, 前者では形態不鮮明でかつ手枝が繁雑であるため細胞や組織での研究には不向きであり, 主に後者による方法によった. probeのBiotin標識はNick translation法とPhoto-Biotin法があるが, 後者の方が良好かつ安定した標識probeが得られた. 本法が最も肝要かつ困難な点は作製細胞標本のRNAの保持, 細胞形態保持にあった. 既に報告されている酵素, 処理液の使用による標本処理でよいが, 実際にはその処理時間の差異が重要で, 標本作製後迅速かつ慎重な操作が必要である. 特に, hybridization後の反応物は洗浄液の濃度の差異により容易に剥離するためその防止には6xSSCを使用する必要がある. この方法ではTPA添加培養細胞は付着細胞自身と剥離洗浄後のcytospin標本いずれでも遺伝子産物が検出され, 従来の分子生物学的方法では困難であった形態との比較検討が可能であった. TPA添加培養細胞HL60ではm/c及びfms遺伝子転写がRNAdot法やNorthern法と同様in situ hybridization法でも確認されたが, 必ずしも全ての細胞に検出されたわけでなく, これら遺伝子発現の解析には本法による個々の細胞レベルでの検討が必要であることが明らかになった. さらに多くのprobeによる検討や, 本法と免疫学的方法による二重染色法の開発, 組織レベルでの検討も進めている.

The study of molecular biology of hematopoietic cells requires a large number of cells, and the Southern method and the Northern method are both necessary. The method of cell morphology and immunology is to compare the results of individual cells and compare them with certain limits. This study is based on the purpose of the in-situ hybridization method and the use of individual cells. Cancer legacy 伝子であるmye and びfms legacy 伝子に対するDNA probeを用い, The differentiation-inducing substance TPA was added to the culture and the Northern method was used to culture the bone ball cell line HL60. Probe's labeling method and radioactive isotopic element labeling method and Biotin labeling method and two methods, The former is a non-distinct morphology, a hand-branched branch, a complex structure, a cell structure, and a tissue study, and the latter is a method. probeのBiotin logoはNick translation methodとPhoto-Biotin methodがあるが, The latter method is good and stable and the identification of the probe is good. The most important point of this method is that it is difficult to prepare cell specimens and maintain the RNA, and the cell morphology is maintained. It is important not to report the enzyme enzyme, use the processing solution, and prepare the specimen, but the difference in processing time is not important, and it is necessary to operate the specimen quickly and carefully after preparation. special, The difference in concentration of the reaction solution after hybridization is easy and easy to peel off, and it is necessary to prevent the use of 6xSSC. The method is to add TPA to the cultured cells and adhere to the cells themselves. After peeling off and washing, the cytospin specimen is removed and the product is left. The method of molecular biology is difficult and difficult. It is possible to compare the shape and form. TPA added cultured cells HL60 m/c and fms are written in RNAdot method and Northern method. In situ The hybridization method is confirmed by the method, and the whole cell is confirmed by the hybridization method.これら缝子発 appear のanalytic には本法による一のcell レベルでの検検question がnecessary であることが明らかになった.さらに多くのprobeによる検问や, 本法とimmunological method による Double staining method の开発, tissue レベルでの検検も入めている.