各種発現系を用いたヒトT細胞白血病ウィルスI型のpX遺伝子産物の作成と機能解析

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1.pX遺伝子産物のリン酸化 ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-I)のpX遺伝子を含む組換えバキュロウィルスを感染させたカイコ培養細胞を放射性オルトリン酸(^<32>p)で代謝標識し、p40^xを免疫沈降後SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した結果、p40^xはリン酸化による修飾を受けていることが判明した。プロテインキナーゼ阻害剤K252aを添加して代謝標識するとリン酸化が阻害されたので、カイコ細胞内の何らかのプロテインキナーゼにより、in vivoでリン酸化がおこると結論づけた。代謝標識後精製されたp40^xを6NHClで加水分解し、二次元薄層クロマトグラフィーによりホスホアミノ酸を分析した結果、ホスホセリンが主たる製粉であると同定できた。HTLV-Iに感染したヒトリンパ球由来細胞株MT-2を用いて同様の実験を行ない、天然のp40^xも組換えp40^xと同様に細胞内のプロテインキナーゼによりセリン残基がリン酸化を受けることを確認した。p40^x蛋白質一次構造上のどのセリン残基がリン酸化を受けるか、リン酸化による修飾がp40^xの機能発現にどのような影響を及ぼすかが今後の課題となった。2.アフィニティークロマトグラフィー法によるp40^xの精製 モルモットの抗p40^x抗血清中のIgG画分を精製し、過ヨウ素酸酸化し、ヒドラジド基を結合したアガロースゲルビーズに結合させイムノアフィニティーカラムを作製した。細胞抽出物中のp40^xをカラムに吸着させ、賛成バッファーまたは尿素により溶出させることにより高純度のp40^x画分を得た。リン酸化阻害剤で処理した細胞からのp40^xやフォスファターゼで脱リン酸化したp40^xを精製し、それらの生理活性を検討するために有効な手段となった。