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蛍光プローブによる筋小胞体カルシウムポンプの分子内作動機構に関する研究

荧光探针研究肌浆网钙泵分子内运行机制

基本信息

批准号：
63580142
负责人：
金沢徹
金额：
--
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.筋小胞体Ca^<2+>-ATPase(Caポンプ)の特異的SH基(Cys^<674>)を蛍光プローブ(I-EDANS)で選択的ラベルし、通常の蛍光光度計とストップトフロー蛍光光度計を用いてCa^<2+>-ATPaseの全触媒過程にわたりラベルの蛍光強度と定常状態蛍光異方性を測定し、次の結果を得た。(1)酵素のCa^<2+>輸送部位にCa^<2+>が結合して酵素が活性化されるとき、蛍光強度と蛍光異方性が若干増大した。(2)Ca^<2+>で活性化された酵素の触媒部位にATPが結合するとき、蛍光強度と蛍光異方性が著明に減少した。(3)反応の過程でリン酸化酵素中間体がADP感受性型からADP非感受性型に変換されるとき、蛍光強度と蛍光異方性が若干減少した(4)逆反応でpiからリン酸化酵素中間体が形成されるとき、蛍光強度と蛍光異方性が著明に減少した。これらの結果は、Ca^<2+>の結合によって酵素が活性化されるときラベルの運動性を制限するような構造変化がラベル近傍で起こること、Ca^<2+>で活性化された酵素の触媒にATPが結合するときラベルの運動性を増大させるような構造変化がラベル近傍で起こること、この構造変化が全触媒過程にわたってdominantであることを示している。更に、この結果は、酵素の触媒部位にATPが結合すると、Cys^<674>に結合したラベルの微環境がより弛緩した状態になること、及びこの弛緩した状態が全触媒過程にわたってdominantであることを示している。2.先に、我々は筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの触媒過程における酵素の異性化がA23187により選択的に阻害されることを示した。本研究では、同じP-typeに属するNa^+,K^+-ATPaseについてA23187の作用を検討し、筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseに対する作用と比較した。その結果、Ca^<2+>-ATPaseの場合と同様、A23187はNa^+,K^+-ATPaseの触媒過程における酵素の異性化を選択的に阻害することが示された。従って、これらのP-type ATPaseにはA23187で阻害される共通の機構が存在すると推定される。

1. The specific SH group (Cys^ ) of Ca^<2+>-ATPase(Ca ~<674>(2 +)) was determined by fluorescence intensity and steady-state fluorescence anisotropy of Ca^<2+>-ATPase in the whole catalytic process. (1)The Ca ^<2+> transport site of the enzyme was activated, and the fluorescence intensity and fluorescence heterogeneity increased to some extent. (2)Ca^<2+> Activation of ATP binding at the catalytic site of the enzyme, light intensity and light anisotropy decrease. (3)In the process of reverse transcription, the enzyme intermediates were changed from ADP sensitive type to ADP non-sensitive type, and the fluorescence intensity and fluorescence anisotropy were decreased to some extent.(4) The enzyme intermediates were formed from reverse transcription, and the fluorescence intensity and fluorescence anisotropy were decreased to some extent. As a result, Ca <2+> binding, enzyme activation, mobility restriction, structural transformation, near-site initiation, Ca <2+> activation, enzyme catalyst ATP binding, mobility increase, structural transformation, near-site initiation, structural transformation, and total catalytic process are shown. In addition, the results of ATP binding in the catalytic site of the enzyme, Cys^<674>binding in the microenvironment of the enzyme, and the relaxation in the microenvironment of the enzyme, are shown in the full catalytic process. 2. In the first place, we showed that the catalytic process of Ca^<2+>-ATPase in muscle cells was inhibited by enzyme differentiation in A23187 In this study, we investigated the role of A23187 in Na^+,K^+-ATPase and compared the role of Ca^+-ATPase in muscle cells of the same P-type. As a result, Ca^<2+>-ATPase is the same as A23187, which is the inhibitor of enzyme heterogeneity in Na^+,K^+-ATPase catalytic process. The existence of a common mechanism for the inhibition of P-type ATPase in the presence of A23187 is presumed.