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活性型ヒト蛋白質の高効率分泌に必要なバチルス・ブレビス遺伝子の解析

高效分泌人类活性蛋白所需的短芽孢杆菌基因分析

基本信息

批准号：
01560119
负责人：
山形秀夫
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

バチルスブレビスを宿主として、その細胞壁蛋白質遺伝子のプロモ-タ-及びシグナル配列部位を用いた異種遺伝子の発現系において、ヒト上皮細胞増殖因子(hEGF)遺伝子は高効率に発現し、240mg/lに達する活性hEGFが培地中に生産された。一方、ヒト唾液α-アミラ-ゼ(hEMY)遺伝子を用いた同様の実験では、当初1mg/l程度のhAMYしか分泌されなかったが、バチルスブレビスの変異株を分離することにより60mg/lに達する分泌生産に成功した。本研究では上記2つの遺伝子の発現効率に影響を与える諸要因について解析するとともに変異株の遺伝的解析を行い、以下の結果を得た。1.バチルスブレビス野生株においては合成されたhAMYは細胞外に分泌されるまでに異常に長い時間(約4時間)が必要であった。変異株においてはこの時間が約2時間まで短縮されていたが、細菌由来のアミラ-ゼと比較すると数十倍長い。これらの結果は、分泌速度が遅いことがhAMYの分泌生産量の低い主要な原因であることを示している。2.逆戻り変異株を解析した結果、変異株は単一の変異によって、hAMY分泌生産量の上昇、細胞壁及び細胞質膜の蛋白質組成の変化、種々の薬剤に対する感受性の上昇等の性質が変化していることが判明した。3.大腸菌においては異種蛋白質を特異的に分析するATP依存性プロテア-ゼLaが存在することが知られている。バチルスブレビスからこれに類似したプロテア-ゼの遺伝子をクロ-ン化し、その全塩基配列を決定した。その結果、大腸菌プロテア-ゼLaとのアミノ酸配列の相同性は52%でありATP結合領域が保存されていることが判明した。現在、バチルスブレビスの本遺伝子が欠損した変異株の分離を行っている。

The expression of hEGF gene was detected at a high efficiency in the development system of xenogeneic gene using the cell wall protein gene expression system and the cell wall protein gene expression system. The hEGF gene was produced in culture at a concentration of 240mg/l. The secretion of hAMY at the level of 1mg/l was successfully achieved by isolating the mutant strains of hAMY at the level of 60mg/l. In this study, the following results were obtained from the analysis of the main factors affecting the occurrence rate of the two genes 1. It is necessary to synthesize hAMY and secrete it outside the cell for a long time (about 4 hours). The length of time of the mutant is about 2 times shorter than that of the mutant. The origin of the mutant is dozens of times longer than that of the mutant. The main reason for the low secretion of hAMY is the secretion rate. 2. As a result of the analysis of different strains, it was found that the characteristics of different strains, such as the increase of hAMY secretion production, the change of protein composition of cell wall and plasma membrane, and the increase of sensitivity to species, changed. 3. E. coli is a heterogeneous protein that is specific to ATP. The basic structure of the system is determined by the following: The results showed that the identity of the acid sequence of Escherichia coli was 52%, and the ATP binding domain was preserved. Now, the isolation of the mutant plants is under way.