バイオターゲティング素子としての抗体断片の高効率生産と構造機能解析

作为生物靶向元件的抗体片段的高效生产和结构功能分析

• 批准号: 12019264
• 负责人: 山形 秀夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12019264/
• 关键词: Bacillus brevis; Fab; 分泌; 融合遺伝子; α-アミラーゼ; CH1ドメイン

抗ヒトウロキナーゼIgG1 Fab遺伝子の断片をBacillus licheniformisのα-アミラーゼ(BLA)遺伝子の上流に融合させ、培地中に蓄積するBLA部分を定量する方法により、CH1ドメインの前半部に存在する配列がB.brevisにおけるH鎖の発現・分泌を主に阻害していることが示唆された。そこでこの部位をコードするcDNAから様々な断片を欠失させ、それぞれについてBLAとの融合遺伝子を作製し、B.brevisの形質転換に用いた。融合遺伝子を導入したB.brevisの培養液中に分泌された遺伝子産物の定量は抗BLA抗体を用いたウェスタンブロット法により行った。この結果、CH1ドメインN-末端の4つの残基の中にB.brevisにおける発現あるいは分泌を阻害するアミノ酸残基が含まれていることが示唆された。B.brevis481株のクリプティクプラスミドであるpWT481を用いて新しい抗体発現ベクターを構築するため、それに見いだされたORFの一つ(ORF3)の機能について解析を行った。pWT481からORF3を欠失させてpHY481ΔORF3を構築し、pWT481の代わりにそれを持つ株(B.brevis481/pHY481ΔORF3)を作製し、様々な条件で培養を行った。その結果、B.brevis481/pHY481ΔORF3は定常期に入ってからそのコロニー形成能がB.brevis481の10分の1以下まで低下すること、また新しい培地へ希釈後の増殖の開始が顕著に遅れることが判明した。ORF3は定常期における増殖能を維持する機能を持ち、pWT481はBebrevis481にこの機能を付与することによりB.brevis481において安定に保持されていると考えられる。

Anti-ヒ トウロキナ ヒトウロキナ ゼIgG1 Fab 伝 sub-fragment をBacillus Licheniformis の alpha ア ミ ラ ー ゼ (BLA) posthumous son 伝 の upper に fusion さ せ, cultivated land in the accumulation of に す る BLA part を quantitative す る method に よ り, CH1 ド メ イ ン の first に exist す る match column が B.b revis に お け る H lock の 発 now, secrete を main に resistance against し て い る こ と が in stopping さ れ た. そ こ で こ の parts を コ ー ド す る cDNA か ら others 々 な fragment を owe lost さ せ, そ れ ぞ れ に つ い て BLA と の fusion heritage を son 伝 し, B.b revis の form quality planning in に with い た. Fusion posthumous son 伝 を import し た B.b revis の medium, に secretion さ れ た heritage 伝 zi chan の quantitative は BLA antibody を resistance with い た ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト method に よ り line っ た. こ の results, CH1 ド メ イ ン N - terminal の 4 つ の residues in の に B.b revis に お け る 発 now あ る い は secretion を resistance against す る ア ミ ノ acid residues が ま れ て い る こ と が in stopping さ れ た. B.b revis481 strains の ク リ プ テ ィ ク プ ラ ス ミ ド で あ る pWT481 を with い て new し い antibodies have 発 ベ ク タ ー を build す る た め, そ れ に see い だ さ れ た ORF の a つ (ORF3) の function に つ い analytical line を っ て た. PWT481 か ら ORF3 を owe lost さ せ て pHY481 Δ ORF3 を constructing し, pWT481 の generation わ り に そ れ を hold つ strains (B.b revis481 / pHY481 Δ ORF3) し, others in the を cropping 々 な で conditions of line を っ た. そ の results, B.b revis481 / pHY481 Δ ORF3 は stationary phase に into っ て か ら そ の コ ロ ニ ー can form が B.b revis481 の under 10 points の 1 ま low で す る こ と, ま た new し い petty へ bush 釈 の の raised after colonization began が 顕 the に 遅 れ る こ と が.at し た. ORF3 は stationary phase に お け る rights can yield を maintain す る function を hold ち, pWT481 は Bebrevis481 に こ の function を give す る こ と に よ り B.b revis481 に お い て settle に keep さ れ て い る と exam え ら れ る.

项目成果

太田敏博: "A comparison of mutation spectra detected by the Escherichia coli Lac^+ reversion assay and the Salmonella Typhimurium His^+ reversion assay."mutagenesis. 15・4. 317-323 (2000)

Toshihiro Ota：“大肠杆菌 Lac^+ 逆转试验和鼠伤寒沙门氏菌 His^+ 逆转试验检测到的突变谱的比较。”诱变 15・4 (2000)。

太田敏博: "Characterization of the mutational specificity of DNA cross-linking mutagenesis by the Lac reversion assay with Escherichia coli"Teratogenesis, Carcinogenesis and mutagenesis. (印刷中). (2001)

Toshihiro Ota：“通过大肠杆菌的 Lac 逆转试验表征 DNA 交联诱变的突变特异性”畸胎发生、癌变和诱变（印刷中）。