腎における尿酸輸送担体のクロ-ニングとその解析

痛風に代表される高尿酸血症は、ただ単に関節疾患にとどまらずむしろ動脈硬化を増悪させる因子として、疾患の欧米化がおきているわが国においては今後最も重要な研究課題になると思われる。高尿酸血症の成因は、尿酸生成の増加あるいは腎臓よりの尿酸排泄の低下であるが、その頻度から後者が圧倒的に問題となる。従って、尿酸排泄を担う分子の同定およびその遺伝子診断は現在のわが国において必須の課題といえる。ヒトの腎臓をmRNA抽出用の臓器とするには、材料の入手が困難であるため、まずラットの腎臓よりその尿酸担体の遺伝子をクロ-ニングし、これをプロ-ブとしてヒトのDNAをクロ-ニングする方法をとった。ラットの腎臓を採取後液体窒素の中で瞬時に凍結し、これより通常の方法でRNAを精製した。このRNAをオリゴ-dTカラムにかけることによりポリ(A)^+-RNAを精製した。このRNAの分解が最小限に抑えられていることは、RNAブロットを行いマウスのMHCクラスI(H-2K^d)の遺伝子である191-6のHindIIIフラグメントが約1.9kbのところにクロスハイブリタイズすることにより確認された。このRNAをXenopus oocyteに微量注入し蛋白を発現させた後に、この中に尿酸の担体となり得るものが存在するかを放射標識した尿酸(^<14>C-Urate)とoocyteを反応させることによりスクリ-ニングした。コントロ-ルと比較してRNAを注入したoocyteにおいては約20%から50%の放射活性の取り込みの上昇が認められたが、時にバックグラウンドと同程度のこともありシグナルが非常に弱いことが考えられた。従って次にこのRNAをショ糖密度勾配によりいろいろな大きさに分画しこれをoocyteに注入し同様の方法により検索したところ、コントロ-ルに比較して2^-3倍に取り込みが増加するフラクションが存在したが、oocyteのロット毎の蛋白発現性が非常に異なり、この方法すなわちショ糖密度勾配によるRNAのフラクショネ-ションの応用を困難にしているのが現状である。

痛風に代表される高尿酸血症は、ただ単に関節疾患にとどまらずむしろ動脈硬化を増悪させる因子として、疾患の欧米化がおきているわが国においては今後最も重要な研究課題になると思われる。高尿酸血症の成因は、尿酸生成の増加あるいは腎臓よりの尿酸排泄の低下であるが、その頻度から後者が圧倒的に問題となる。従って、尿酸排泄を担う分子の同定およびその遺伝子診断は現在のわが国において必須の課題といえる。ヒトの腎臓をmRNA抽出用の臓器とするには、材料の入手が困難であるため、まずラットの腎臓よりその尿酸担体の遺伝子をクロ-ニングし、これをプロ-ブとしてヒトのDNAをクロ-ニングする方法をとった。ラットの腎臓を採取後液体窒素の中で瞬時に凍結し、これより通常の方法でRNAを精製した。このRNAをオリゴ-dTカラムにかけることによりポリ(A)^+-RNAを精製した。このRNAの分解が最小限に抑えられていることは、RNAブロットを行いマウスのMHCクラスI(H-2K^d)の遺伝子である191-6のHindIIIフラグメントが約1.9kbのところにクロスハイブリタイズすることにより確認された。このRNAをXenopus oocyteに微量注入し蛋白を発現させた後に、この中に尿酸の担体となり得るものが存在するかを放射標識した尿酸(^<14>C-Urate)とoocyteを反応させることによりスクリ-ニングした。コントロ-ルと比較してRNAを注入したoocyteにおいては約20%から50%の放射活性の取り込みの上昇が認められたが、時にバックグラウンドと同程度のこともありシグナルが非常に弱いことが考えられた。従って次にこのRNAをショ糖密度勾配によりいろいろな大きさに分画しこれをoocyteに注入し同様の方法により検索したところ、コントロ-ルに比較して2^-3倍に取り込みが増加するフラクションが存在したが、oocyteのロット毎の蛋白発現性が非常に異なり、この方法すなわちショ糖密度勾配によるRNAのフラクショネ-ションの応用を困難にしているのが現状である。