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生理活性ペプチド,エンドセリンの受容体サブタイプの解析と精製

生物活性肽内皮素受体亚型的分析和纯化

基本信息

批准号：
02671102
负责人：
高柳涼一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至 1991
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ヒトおよびブタ各組織におけるエンドセリン(ET)受容体サブタイプの解析:ヒトおよびブタ各組織より調製した膜標品を用いてのAffinity labelingと結合実験の結果,各組織には主として2つの型のET容体,即ちETー1,ETー2に親和性を有するETー1/ETー2特異受容体(ET_A)とET isopeptide全てに親和性を有するET family共通受容体(ET_B)が部位特異的に分布していることを見い出した.即ち,心血管系では主としてET^A受容体、脳、副腎、腎では主としてET_B受容体、肺では両者が分布していた。また、血管系では内皮上にET_B受容体、平滑筋上にET_A受容体が局在、各々、弛緩と収縮に連関しており,血管でのET受容体サブタイプの機能分化を証明した。2.エンドセリン(サラホトキシン)アフィニティ-クロマトグラフィ-の開発:種々のET及びET類似ペプチドのサラホトキシン(SRT)の誘導体を合成、SRTの4位のリジンをbiocytinと置換したペプチド、[Bio^4]SRTが最適リガンドであることを見いだし、アビジンを介してアガロ-スに架橋し、[Bio^4]SRTカラムを作成、可溶化受容体の結合、解離に成功した。3.ウシ脳のET_B受容体の精製し一部アミノ酸構造の決定:[Bio^4]SRTカラムとさらにゲル濾過によりウシ脳よりET_B受容体蛋白を得た。分子量は50Kであった。プロムシアン断片ペプチドより一部アミノ酸構造を決定した。4.ヒトET_B受容体cDNAのクロ-ニングによる一次構造の決定:ウシ脳と肺からの精製ET_B受容体の一部アミノ酸構造を基にオリゴヌクレオチドプロ-ブを合成,ヒト肝のcDNA libraryよりET_B受容体をクロ-ニング、その一次構造を決定、さらにCOS細胞で発現させ、結合特異性を検討した。さらに、他の受容体サブタイプのクロ-ニングを試みている。

1. Affinity labeling and binding analysis of ET receptors in various tissues: Affinity labeling and binding results of ET receptors in various tissues, i.e., ET 1/ET 2 specific receptors (ET_A) and ET isopeptide total affinity, showed site-specific distribution of ET family common receptors (ET_B). That is, the cardiovascular system is divided into two parts: ET^A receptor, kidney, kidney, ET_B receptor and lung This paper demonstrates the functional differentiation of ET_B receptor on endothelium and ET_A receptor on smooth muscle. 2. Development of SRT: Synthesis of inducer of seed ET and ET-like SRT, biocytin substitution of SRT at position 4, selection of SRT at position 4, dissolution of SRT at position 4, bridging of SRT at position 4, dissolution of SRT at position 4, and dissociation of SRT at position 4. 3. The purification of ET_B receptor and the determination of its partial acid structure:[Bio^4]SRT culture and filtration are necessary to obtain ET_B receptor protein. The molecular weight is 50K. A part of the acid structure is determined by the number of fragments. 4. The determination of the primary structure of ETB receptor cDNA: the synthesis of a part of the purified ETB receptor cDNA library; the determination of the primary structure of ETB receptor cDNA; the development of COS cells; and the investigation of binding specificity. He is the recipient of a large amount of information.