ヒトピルビン酸キナ-ゼcDNAを用いた遺伝子治療法の基礎的研究

利用人丙酮酸激酶cDNA进行基因治疗的基础研究

• 批准号: 02671121
• 负责人: 谷 憲三朗
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02671121/
• 关键词: ヒトL型ピルビン酸キナ-ゼ; 遺伝子治療; レトロウィルスベクタ-; 骨髄移植; ヘルパ-細胞

遺伝性溶血貧血の遺伝子治療法の確立を目的として,先ずヒトもしくはマウス血液細胞中への、ヒトL型ピルビン酸キナ-ゼ(PK)cDNAの導入をはかった。すなわち,レトロウィルスベクタ-(pMNSM)DNAにヒトL型PK cDNAを挿入し,LPKレトロウィルスプラスミドpMNーPKLを作製した。次にpMNSMーPKL DNAもしくはpMNSM DNAを各々別に,パッケ-ジング細胞株GP+env Amー12中にリン酸カルシウム法にて導入させた。細胞株はamphotropic細胞株であるが,この細胞株より得られたウィルス液の力価は1×10^4/ml低値であった。そこで、GP+86というecotropic細胞株に各DNAを導入し、それぞれのDNAに対応するecotropic細胞株とamphotropic細胞株を共培養することで,約1×10^6/mlと高力価のウィルス産生細胞株(ヘルパ-細胞)を得ることができた。このヘルパ-細胞染色体には明らかにpMNSMーPKL DNAが組み込まれていた。しかも、ヒトL型PKがmRNAレベルならびに蛋白質のレベルで発現していることが確認できた。次にこのヘルパ-細胞培養上清とNIH3T3細胞、FDCPー2(マウス白血病細胞株),HEL,KU812(ともにヒト白血病細胞株)の各細胞を共培養することで,これらの細胞をレトロウィルスで感染させた。被感染細胞染色体にはやはり,pMNSMーPKL DNAの組み込みがみとめられ、さらにヒトL型PK mRNAの発現がノザン法ならびにRTーPCR法で確認された。現在、マウス骨髄幹細胞(Lyn^ー,cーkit^ー)の濃縮をFACSにておこない,この細胞に上記と同様の方法でPMNSMーPKL DNAを導入し,マウスに骨髄移植を行い、生着した血球細胞中にヒトL型PK mRNAの発現をみとめるか否かを検討中である。この一連の研究結果は、PK異常に伴う遺伝性溶血性貧血の遺伝子治療法確立の為に大変重要な示唆を与えてくれるものである。

To establish a gene therapy for hereditary hemolytic anemia, we need to introduce L-type cDNA into blood cells. LPK cDNA was inserted into pMNSM DNA and LPK cDNA was produced from pMNSM DNA. The pMNSM PKL DNA was introduced into the cell line GP+env Am-12 by the same method as pMNSM DNA. Cell strain amphotropic cell strain DNA was introduced into GP+86 and GP+86 ecotropic cell lines, and DNA was introduced into GP +86 ecotropic cell lines and GP +86 ecotropic cell lines. Co-culture of GP+86 ecotropic cell lines and GP +86 ecotropic cell lines resulted in cell lines (GP +86 and GP +86 cells) with high power of about 1×10^6/ml. The pMNSM-PKL DNA is assembled in the middle of the cell chromosome. L-type PK mRNA and protein were detected and confirmed. The supernatant of NIH 3T3 cells, FDCP-2(leukemia cell line),HEL,KU812(leukemia cell line) were co-cultured and infected. The expression of L-type PK mRNA in infected cells was confirmed by PCR and DNA sequencing. Now, the concentration of bone stem cells (Lyn^^,c ^^) in FACS, the same method for introducing PMNSM PKL DNA into these cells, and the expression of L-type PK mRNA in bone transplantation and hematopoietic cells are discussed. The results of this series of studies indicate that the establishment of genetic therapy for PK abnormalities associated with hereditary hemolytic anemia is important.

项目成果

Tani,K.,Ozawa,K.,Ogura,H.,Takahashi,T.,Okano,A.,Watari,K.Matsudaira,T.et.al.,: "Implantation of fibroblast transfected with human granulocyte colonyーstimulating factor (GーCSF) cDNA into mice as a model of cytokine supplement gene therapy." Blood. 74. 1274

Tani, K.、Ozawa, K.、Ogura, H.、Takahashi, T.、Okano, A.、Watari, K. Matsudaira, T. 等人：“用人粒细胞集落刺激转染的成纤维细胞的植入将因子 (G-CSF) cDNA 注入小鼠体内，作为细胞因子补充基因治疗的模型。” 血液。74. 1274

Ogura,H.,Tani,K.,Ozawa,K.,Nagata,S.,Asano,S.and Takaku,F.: "Implantation of genetically manipulated fibroblasts into mice as antitumor alpha interferon therapy" Cancer Resaarch. 50. 5102-5106 (1990)

Ogura,H.、Tani,K.、Ozawa,K.、Nagata,S.、Asano,S. 和 Takaku,F.：“将基因操纵的成纤维细胞植入小鼠体内作为抗肿瘤 α 干扰素疗法”癌症研究。

谷 憲三朗: "造血幹細胞への遺伝子導入" 医学のあゆみ. 156. 141-148 (1991)

Kenzaburo Tani：“基因转移到造血干细胞”医学史 156. 141-148 (1991)。