微生物のセロビオース及びセロデキストリンフォスフォリラーゼに関する研究

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近年様々なオリゴ糖に対する関心が高くなってきている、セロオリゴ糖は未開発なオリゴ糖の一つである、C.thermocellumのセロビオースホスホリラーゼ(CBPase)およびセロデキストリンホスホリラーゼ(CDPase)の加リン酸分解の逆反応を利用すると、グルコースとグルコース1リン酸からセロオリゴ糖が合成できるのことが分かった。本研究において、これら酵素の生産性の改良と、構造の検討を目的として両遺伝子のクローニングを計画、実施した。クロストリジウムの菌体内から精製した両酵素をトリプシンで消化し、各ベプチドのアミノ酸配列を決定した。この配列からCBPaseに対するプローブ1種類とCDPaseに対するプローブ2種類を設計した。合成プロープを用いてCBPase遺伝子のクローニングを行なった。ゲノムのザザンプロッティングにより、ハイブリッド形成する制限酵素消化断片をpUC18に挿入し、大腸菌DH5αを形質転換した。ゲノムライブラリーをコロニーハイブリダイゼーションによって検索した結果、Hid III断片が挿入された12個のコロニーを得た。しかし、このプラスミド断片内に一般的な制限酵素サイトは存在しなかった。同様な手法でDCPase遺伝子のクローニングを行った。Hind III消化断片(1.5Kb付近)から得たゲノムライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションによる検索を行い、24個のコロニーを得た。これらが保持しているプラスミドの制限酵素地図から、すべてに同じDNA断片(1.5kb)が挿入されていることが分かった。現在この断片の塩基配列を決定中である。