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固相化リンカーを用いたゲノム上特定領域のリンキングライブラリー作製法

使用固定化接头为基因组上特定区域创建连接库的方法

基本信息

批准号：
04557017
负责人：
林崎良英
金额：
$ 2.3万
依托单位：
National Cardiovascular Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1、固相化リンカー(NotI trapper)の作成我々は本研究に用いた固相化リンカーとして制限酵素NotIの認識配列をその末端にもったヘアピンリンカーをそのループの部分でラテックス樹脂表面に共有結合で固定したものを作成した。ヘアピンリンカーを用いることにより、一本鎖DNAの合成のみで良く、熱によって変性させても効率よく再生する固相化リンカーを作ることに成功した。2、固相化リンカーの使用法1)ゲノムDNAをNotIで切断し、NotI末端を持つ固相化リンカーにアニールさせ、結合酵素(リガーゼ)を用いてラテックス粒子に固定する。2)結合しなかった非特異的DNA断片を洗浄除去する。3)ラテックス粒子に固定したDNA断片を再びNotIにて切断してNotI末端のみ持つものを回収する。3、固相化リンカーの特性1)高い選択性--NotIによる再切断によって、DNA断片を回収するため、制限酵素の特異性を反映した高い選択性が得られ、NotI断片を10万倍以上に濃縮することができる。2)均一な回収率--結合するDNA断片の長さにかかわらず40%の比較的高い回収率が得られる。4、固相化リンカーを用いたNotIリンキングライブラリー、バウンダリーライブラリー作製法の確立リンキングライブラリー作成においては、ゲノムDNAをBamHIで切断して、希釈下で同一のDNA断片の末端間でライゲーションし、NotIで切断した。この反応物の中から、固相化リンカーを用いてNotI断片のみを精製し、ラムダファージに組み込みクローニングした。その結果、970万個のNotIリンキングクローンを得ることに成功した。バウンダリーライブラリーにおいても同様に優れた結果を得ることができた。5、現在は特定制限酵素末端の回収のみならず、ゲノムDNAの特定部位を選択的に標識する方法としても検討中であり応用範囲の広い方法として用いられるであろう。

1. Solid-phase synthesis (NotI trapper). In this study, we used the solid-phase method to make restriction enzyme NotI. In this study, we used the end-to-end method to make the enzyme restriction enzyme. In this case, you can use a book called DNA to synthesize a good product. You can use a copy of a copy of the book to synthesize a good product. 2. The use of solid phase method 1) DNA NotI cut off, the end of NotI holds the solid phase reaction, the binding enzyme (enzyme) is used to fix the particles. 2) combined with the non-specific DNA fragments, the samples were washed and removed. 3) DNA fragments fixed, NotI fragments cut, NotI ends fixed, particles fixed, NotI fragments fixed, NotI fragments cut again, NotI ends fixed, particles fixed, fragments cut again, cut again, cut back. 3. The characteristics of solid phase reaction 1) High selectivity-- NotI fragments cut off again, DNA fragments reflect high selectivity, NotI fragments reflect high selectivity, and NotI fragments are more than 100000 times higher. 2) uniform return rate-combined with the high return rate of 40%, which is higher than that of DNA fragments. 4. To make sure that the DNA fragments are cut in the end of the NotI fragments, the NotI fragments are cut off in the end of the DNA fragments. 4. To make sure that the DNA fragments are cut off in the same way, make sure that they are in good condition. In the reverse part of the material, the solid-phase reaction system was used to analyze the quality of the NotI fragments. The results showed that 9.7 million NotI failures were successful. Please tell me that you have received the same results as you did. 5. Now, in the "tag" method selected in the "specific restriction enzyme terminal" and "DNA" selected "tag" method, "range"method" is used.