哺乳類器官形成期胚の操作技術の開発-頭部神経堤細胞の機能解析に対する応用-

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1.特異的な顎顔面奇形を誘発するレチノイン酸処理ラット胚の解析前年度までに全胚培養下のラット胚に対する発生時期特異的なレチノイン酸処理により、特異的な顔面奇形を誘導する実験系を確立し、頭部神経堤細胞の挙動を蛍光色素Dilのインジェクションによって検討した。今年度はそれらの結果をもとに、レチノイン酸処理ラット胚の脳神経の発生異常を神経特異的な抗体(2H3)を用いたwhole mount免疫組織化学染色によって検討した。その結果、胎齢9.0日ラット胚をレチノイン酸処理した場合、三叉神経の眼枝の形態は正常発生胚を変わらなかったが、上顎枝、および下顎枝は典型的な形態を失っていた。このことは、本来第二咽頭弓へ移動するべき神経堤細胞が元来のアイデンティティーを失ったために第一咽頭弓領域である三叉神経節に移動したこととよく対応し、三叉神経のアイデンティティーも損なわれているものと解釈された。これに対し、胎齢9.5日胚ラットをレチノイン酸処理した場合は、咽頭弓の癒合とともに三叉神経節と顔面神経節も癒合することが観察されたが、三叉神経の形態自体は正常発生胚のものと変わらなかった。癒合した咽頭弓中で頭部神経堤細胞の分節的な移動パターンは保持されていたことから、この場合は神経節を構成する神経堤細胞のアイデンティティーは変わらなかったことが示唆された。2.インジェクションシステムと他の培養法との組合せ前年度までの研究により、哺乳類全胚培養とインジェクションシステムを組み合わせた実験系は、哺乳類胚の頭部神経堤細胞の挙動を検索する局面で有用なツールであることが明示された。そこで今年度は、上記の組合せにさらに器官培養を組み合わせた実験系の可能性を検討した。これは、哺乳類全胚培養で培養可能な期間を越えて特定の組織の発生を追跡したい場合に、非常に有用であると考えられる。胎齢9.5日ラット胚の頭部神経堤細胞をインジェクションシステムを用いてDil標識し、第1咽頭弓領域まで移動する時期まで全胚培養した。その後、下顎領域を切り出して器官培養を行い、歯の原基である歯胚の形成が起こる時期まで培養した。なお、器官培養と組合わせない全胚培養のみでは、歯胚が形成される時期まで培養することは、現時点では不可能である。歯胚の形成過程において、下顎上皮細胞とその直下の間歯細胞との相互作用が不可欠であることは既に報告されており、その間様細胞に頭部神経堤細胞が関与していることも示唆されている。しかし、歯胚を構成する間葉細胞に頭部神経堤細胞が直接存在しているのかどうか、少なくとも哺乳類胚では調べられていなかった。上記の器官培養と組合わせた方法により、歯胚を構成する間葉細胞に中脳領域由来の頭部神経堤細胞が直接存在していることを示唆する結果が得られた。