Bacillus brevisを用いたヒト・繊維芽細胞増殖因子の分泌生産

利用短芽孢杆菌分泌生产人成纤维细胞生长因子

• 批准号: 05760066
• 负责人: 加藤 雅士
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760066/
• 关键词: FGF; 繊維芽細胞増殖因子; 蛋白質分泌生産; シグナルペプチド; Bacillus brevis; 血管内皮細胞; 血管新生; 宿主・ベクター系

Bacillus brevisを用いた繊維芽細胞増殖因子(FGF)の高効率分泌生産の検討をした。1.FGFにB.brevisの細胞壁蛋白質MWPシグナルペプチドを遺伝子レベルで融合した場合、FGFの有意な蓄積は認められなかったが、シグナルペプチドを改良(アミノ末端に2つのアルギニン残基、中央疎水領域に3つのロイシン残基を挿入)することにより初めて、FGFと思われる産物(抗FGF抗体と特異的に反応する)を確認することができた。この産物の分子量はFGF標品の分子量よりも1000ほど大きかった。シグナルペプチドの切断が予想とは異なる部位で起きており、FGFのアミノ末端に余分なアミノ酸配列が付加していると結論した。以後この産物をFGF'と呼ぶことにする。FGF'は培地画分ではなく、細胞画分に分画された。菌体表面に吸着している可能性を考え、他の蛋白質生産で効果のあった界面活性剤を培地中に添加したが、培地画分へのFGF'の遊離は認められなかった。存在状態を調べるために、菌体の外側からプロテアーゼを作用させる実験を行った。その結果、FGFと思われる産物は外側から加えたプロテアーゼに対し安定であることが明らかとなった。この産物は細胞壁あるいは細胞質膜の内側に存在し、分泌過程のいずれかの段階で止まってしまっていると考えた。FGFは典型的な分泌蛋白質とは異なり、元来シグナルペプチドを持たない。現在もなお、その分泌機構は不明である。FGFは分泌に適さない何らかの構造を有しているのかもしれない。2.FGF発現・分泌プラスミドを安定に保持する変異株の取得に成功し、この変異株を用いることにより、本研究を遂行することが出来た。3.B.brevis由来のプラスミドを用いた生産性の高いベクターの開発については行うことができなかった。4.培地組成、培養温度等、培養条件を検討した結果、5mg/l程度のFGF'の生産に成功した。

Bacillus brevisを produced by <s:1> high-efficiency secretion of germ cell proliferative factor (FGF) <s:1> 検 for を た. 1. FGF に B.b revis の cell wall proteins MWP シ グ ナ ル ペ プ チ ド を posthumous son 伝 レ ベ ル で fusion し た occasions, accumulation of FGF の intentionally な は め ら れ な か っ た が, シ グ ナ ル ペ プ チ ド を improvement (ア ミ ノ end に 2 つ の ア ル ギ ニ ン residues, central 疎 water areas に 3 つ の ロ イ シ ン residues を scions into す る こ と Early に よ り め て, FGF と わ れ る product (FGF antibody と specific に resistance against 応 す る) を confirm す る こ と が で き た. <s:1> the product of <s:1> has a molecular weight of <s:1> FGF. The standard product of <s:1> has a molecular weight of よ ほ ほ 1000ほ large <s:1> った った. シ グ ナ ル ペ プ チ ド の cut が to think と は different な back で る き て お り, FGF の ア ミ ノ end more than に points な ア ミ ノ acid with column が plus し て い る と conclusion し た. In the future, <s:1> <s:1> products をFGF'と call ぶ とにする とにする. FGF' で pettidic score で なく, cell score に score された. Bacteria on the surface of に sorption し て い る possibility を え, he の protein production test で unseen fruit の あ っ た interface active tonic を に added in the petty し た が, pei to draw points へ の FGF 'の free は recognize め ら れ な か っ た. Existence state を regulation べるために, outer side of the <s:1> of the bacterial body らプロテア らプロテア ゼを effect させる experiment を row った. そ の results, FGF と わ れ る product は lateral か ら plus え た プ ロ テ ア ー ゼ に し seaborne settle で あ る こ と が Ming ら か と な っ た. こ の product は cell wall あ る い は に exist し の inside cell plasma membrane and secreted process の い ず れ か の Duan Jie で check ま っ て し ま っ て い る と exam え た. FGF is a typical な secreted protein と isomeric な and progenitor シグナ ペプチドを ペプチドを holds たな ペプチドを. At present, the secretory mechanisms of である なお and そ are unknown である. FGF secretes に, さな, ら, and its structure を includes <s:1>, て, る, <s:1>, <s:1>, <s:1>, れな, れな. 2. The secretion of FGF 発 now, プ ラ ス ミ ド を settle に keep す る - different strains の し に success, こ の - different strains を with い る こ と に よ り, を carries out this study す る こ と が た. 3. B.b revis origin の プ ラ ス ミ ド を with い た high productive の い ベ ク タ ー の open 発 に つ い て は line う こ と が で き な か っ た. 4. Composition of the culture medium, culture temperature, etc., culture conditions を検 discussion of た results, 5mg/l degree <s:1> FGF' <e:1> production に successful <s:1> た.

项目成果

MasashiKato: "Translocation of conjugated presecretory proteins possessing an internal non-peptide domain into everted membrane vesicles in Escherichia coli" The Journal of Biological Chemistry. 268. 3586-3593 (1993)

MasashiKato：“具有内部非肽结构域的缀合前分泌蛋白易位到大肠杆菌的外翻膜囊泡中”《生物化学杂志》。