糸状菌転写促進因子CCAAT結合複合体のサブユニットに関する機能ドメイン解析

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(1)部分欠失Hapサブユニットのhap欠失株への導入:前年度ではHap複合体を形成するサブユニットHapB,C,Eそれぞれの部分欠失遺伝子を作製して、リコンビナントタンパク質を調製し、in vitroでの解析を進めてきた。本年度はこれら部分欠失遺伝子を用い、我々の開発した糸状菌cDNA発現ベクターを利用して、それぞれhapB,hapC,hapE欠失株を形質転換した。その結果HapEに関しては、中央の真核生物間の配列保存領域のみで転写促進に十分であることが分かった。in vitro実験でDNA結合能を持つことが明かとなっているHapCのN末端欠失変異(HapCdN)およびHapBのC末端欠失変異(HapBdC)はin vivoでは転写促進能を持たないことが明かとなった。さらなる解析より、細胞内のHapCdN量が極めて少ないことが明かとなり、N末部分がHapCの細胞内での安定性に関与していることが示唆された。HapBdCは転写促進能を持たないことが明らかになったが、総抽出タンパク質を用いたDNA結合実験ではDNA結合性を有することが明かとなった。DNA結合以外の機能がC末部分に存在することが示唆された。(2)部分欠失サブユニットの核への局在化能の解析:HapBdCの核への局在化能を調べるために、前年度に確立した核のフラクショネーション法により核を分離後ウェスタン解析を行った。その結果、全長HapBは効率よく核局在化するのに対し、HapBdCは核には殆ど存在していなかった。この結果より、HapBのC末部位には核への局在に必要な領域が存在することが明かとなった。