糸状菌におけるマルトース輸送系の分子生物学的解析

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本研究は糸状菌における、マルトースの細胞内への取り込み機構を解析し、マルトースのシグナルの細胞内への伝達機構を解明することを目的としたものである。申請者らは糸状菌Aspergillus nidulansの細胞抽出液よりアフィニテイーカラム(アミロースカラム)に特異的に結合し、マルトースで溶出される分子量80Kのタンパク質の同定に成功した。1.このアミロースカラムを用いて、80Kタンパク質の精製に成功し、約20マイクログラムのタンパク質試料を得た。2.精製80Kタンパク質のN末端アミノ酸配列の決定を試みたところ、十分なタンパク質量の試料を用いても不成功に終わり、そのN末端が修飾されていることが示唆された。そこでこの80Kタンパク質をV8プロテアーゼで部分消化し、ペプチド断片を得、このペプチドを用いてアミノ酸シークエンシングを行った。その結果、一つのペプチドのN末端アミノ酸配列は、SHCQALVGDKILMと決定された。この配列は酵母のグリコーゲンブランチングエンザイムと非常に高い相同性を示した。このアミノ酸配列をもとにDNAを合成し、現在、Aspergillus nidulansの_cDNAライブラリーより、グリコーゲンブランチングエンザイム遺伝子をクローニングすることを検討している。3.プロトプラストを用いた放射性マルトース取り込みの解析4.あるいは可溶化・再構成系を用いたマルトーストランスポーターの解析については行うことができなかった。