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耐熱性ペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼ遺伝子の解析

热稳定性胃酶抑素不敏感的羧基蛋白酶基因分析

基本信息

批准号：
05760086
负责人：
尾山廣
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Sojo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760086/
关键词：
ペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼ耐熱性酵素

项目摘要

Bacillus novosp.MN-32株の産生する耐熱性ペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼは、耐熱性のみならず基質特異性や阻害剤に対する挙動など非常にユニークな性質を持っている。本研究課題では本酵素の一次構造並びに触媒昨日を遺伝子レベルから解明するために、酵素遺伝子のクローニングを行った。本年度の研究成果は以下に示すとおりである。1.Bacillus novosp.MN-32株の培養上清120リットルから、各種カラムクロマトグラフィーで22mgの酵素タンパクを得た。この酵素をトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、サーモリシン等のプロテアーゼで限定分解し、逆相HPLCで各消化ペプチド断片を分離精製後、それらのアミノ酸配列を自動アミノ酸アナライザーにより約100残基分が決定した。この中からプローブDNA作成のためにコドン選択率の低いアミノ酸配列を2ヶ所選び、耐熱性酵素がGC含量が多いことを考慮に入れてコドンの3番目の塩基を、a)GまたはC、b)イノシンとして2種類のプローブDNAを化学合成した。プローブの標識は蛍光基質や^<32>Pで行い、酵素遺伝子のスクリーニングに用いた。2.Bacillus novosp.MN-32株の染色体DNAはSaito-Miura法を改良した方法で調整し、各種制限酵素で完全消化後、1の標識プローブDNAでサザンハイブリダイゼーションを行った。約3kbpのSalI断片に目的遺伝子があることが分かり、プラスミドpUC18の同部位に挿入後、E.coli DH5alphaを形質転換した。得られた各形質転換体からコロニーハイブリダイゼーション法で目的酵素遺伝子を組み込んだクローンを選抜し、E.coli DH5alpha/pK1株を得ることに成功した。この得られたプラスミドpK1の制限酵素地図を作成し、プローブDNAとハイブリダイズしたところ、約0.5kbpのBamHI消化断片に目的酵素遺伝子の存在が推定された。現在、その断片を含んだ領域の塩基配列を決定中である。

Production of Bacillus novosp.MN-32 strain is characterized by heat tolerance, matrix specificity and resistance. This research topic is about the primary structure of the enzyme and the development of the enzyme gene. This year's research results are shown below. 1. Bacillus novosp.MN-32 strain culture supernatant 120 mg, all kinds of culture medium 22mg enzyme medium The enzyme is decomposed in a limited manner, and the digestion fragments are separated and purified by reverse-phase HPLC, and the acid sequence is automatically determined by about 100 residues. In this paper, we introduce the chemical synthesis of DNA from three kinds of enzymes: a)G; b) C; c) D. The logo of the enzyme is used in the identification of the substrate<32>. 2. Bacillus novosp.MN-32 strain chromosome DNA modified Saito-Miura method to adjust, after a variety of restriction enzymes to complete digestion, 1 of the identification of the DNA from the top to bottom About 3kbp of SalI fragment was inserted into pUC18 and transformed into E.coli DH5alpha. The E.coli DH5alpha/pK1 strain was successfully isolated. The restriction enzyme fragment of pK1 was constructed and the presence of the target enzyme fragment was estimated from the BamHI digestion fragment of about 0.5 kbp. Now, the fragment contains the domain of the base of the decision.