非ペプシン型カルボキシルプロテアーゼ活性中心の検索と構造機能相関

寻找非胃蛋白酶羧基蛋白酶活性中心及构效关系

• 批准号: 06780479
• 负责人: 井上 英史
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780479/
• 关键词: 非ペプシン型酸性プロテアーゼ; アスパラギン酸プロテアーゼ; 活性中心; アスペルギルス・ニガ-

結果1. Aspergillus niger var.macrosporusが分泌する非ペプシン型酸性プロテアーゼであるプロクターゼAの活性中心残基を検索するために化学修飾を行った。プロクターゼAはpH6以上で不可逆的に失活するので用いることのできる反応は限定される。本研究ではカルボキシル基、トリプトファン、ヒスチジンに対する化学修飾を行った。その結果、カルボキシル基の収縮により活性の低下が見られ、トリプトファンやヒスチジンは修飾されなかった。結果2. アスパラギン酸残基・グルタミン酸残基を標的に部位特異的変異を行った。プロクターゼAはScytalidium lignicolumのプロテアーゼBとアミノ酸配列が50%一致することから、活性中心は両者の間で保存されていると考えられる。そこで保存されている16個のアスパラギン酸及びグルタミン酸残基をそれぞれアスパラギンまたはグルタミンに変換した変異体を作製し、活性を測定した。その結果、Asp123とAsp220を変異した場合のみに活性が消失した。結論 この2つの残基は近傍に分子内ジスルフィド結合が存在することから、高次構造上で近くに位置すると考えられ、プロクターゼAはペプシン型アスパラギン酸プロテアーゼと同様に2つのアスパラギン酸残基が活性中心を形成していると考えられる。プロクターゼAはペプシン型アスパラギン酸プロテアーゼと一次構造の共通性が全く見られないことから、収斂進化により触媒機構の類似した2つのアスパラギン酸ファミリーが存在すると予想される。

Results 1. Aspergillus Niger var. Macrosporus が secretion す る non ペ プ シ ン type acid プ ロ テ ア ー ゼ で あ る プ ロ ク タ ー ゼ A の active center residues を 検 cable す る た め に chemically modified line を っ た. Above プ ロ ク タ ー ゼ A は pH6 で irreversible に inactivation す る の で with い る こ と の で き る anti 応 は qualified さ れ る. This study で は カ ル ボ キ シ ル base, ト リ プ ト フ ァ ン, ヒ ス チ ジ ン に す seaborne る chemically modified line を っ た. そ の results, カ ル ボ キ シ ル base の 収 shrinkage に よ り active low の が see ら れ, ト リ プ ト フ ァ ン や ヒ ス チ ジ ン は modified さ れ な か っ た. Result 2. Youdaoplaceholder0 <s:1> acid residue · グ グ タ タ タ アスパラギ <s:1> acid residue を specific variation at the に site of the target を row った. プ ロ ク タ ー ゼ A は Scytalidium lignicolum の プ ロ テ ア ー ゼ B と ア ミ ノ acid with 50% が consistent す る こ と か ら, active center は who struck between の で save さ れ て い る と exam え ら れ る. そ こ で save さ れ て い る 16 の ア ス パ ラ ギ ン acid and び グ ル タ ミ ン acid residues を そ れ ぞ れ ア ス パ ラ ギ ン ま た は グ ル タ ミ ン に variations in し た - variant を cropping し, determination of active を し た. Youdaoplaceholder0 そ result, Asp123とAsp220を variation <s:1> た situation <e:1> みに みに activity が disappearance た た. Conclusion こ の 2 つ の residues は nearly alongside に intramolecular ジ ス ル フ ィ ド combining が exist す る こ と か ら, higher order structure on nearly く で す に position る と exam え ら れ, プ ロ ク タ ー ゼ A は ペ プ シ ン type ア ス パ ラ ギ ン acid プ ロ テ ア ー ゼ と with others に 2 つ の ア ス パ ラ ギ ン acid residues が active center を form し て い る と exam え ら れ る. プ ロ ク タ ー ゼ A は ペ プ シ ン type ア ス パ ラ ギ ン acid プ ロ テ ア ー ゼ と A tectonic の convergence が く see all ら れ な い こ と か ら, 収 gathered evolution に よ り catalytic institutions の similar し た 2 つ の ア ス パ ラ ギ ン acid フ ァ ミ リ ー が exist す る と to think さ れ る.

项目成果

Naofumi Kagami: "Expression in E.Coli of Aspergillus niger vav.macrosporus proteinaseA,a non-pepsin type acid proteinase" Aspartic Proteinases:Structure,Function,Biology and Biological Implications, Plenum Press. (印刷中). (1995)

Naofumi Kagami：“黑曲霉大孢子蛋白酶 A（一种非胃蛋白酶型酸性蛋白酶）在大肠杆菌中的表达”天冬氨酸蛋白酶：结构、功能、生物学和生物学意义，Plenum Press（出版中）。