ヒト胎児肝細胞cDNAライブラリーを用いた造血幹細胞増幅因子cDNAクローニング

利用人胎肝细胞cDNA文库克隆造血干细胞扩增因子cDNA

• 批准号: 05770796
• 负责人: 高橋 聡
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770796/
• 关键词: G-CSF; CML; 多能性造血幹細胞; cDNAライブラリー; GIG-1クローン; 胎児肝細胞

G-CSFは顆粒球系の分化、増殖因子であるのみならず造血幹細胞をも刺激することが知られている。我々は、先ずG-CSFの刺激に応じて発現が増強される遺伝子cDNAのクローン化を、G-CSFにより分化誘導をうけ、かつ多能性造血幹細胞レベルでの単クローン性増殖性疾患であるCML-CP患者骨髄単核球を用いておこなった。これは分化停止機構で特徴づけられるAMLの病態解明およびその治療に重要な情報を与えるのみならず多能性幹細胞に対する増幅因子に反応して発現増強するマーカー遺伝子としてももちいることができると考えられた。方法としては先ずCML-CP患者骨髄単核球をG-CSF存在下で18時間培養後に回収しRNA抽出後mRANを精製し、lambdagt10cDNAライブラリーを作成し、次にG-CSF刺激、無刺激CML細胞由来のcDNAをスクリーニング用のプローブとして、24個のG-CSF刺激プローブにより特異的にハイブリダイズするクローンを選択した。このうち1クローン(GIG-1)のmRNAは約0.9kbであり、G-CSF刺激CML細胞でその発現が増強する遺伝子であるのみならず、主に骨髄系白血病細胞株で発現することが確認された。さらに我々は同様な手法を用いて胎生期初期造血の場として重要な胎児肝細胞から、造血幹細胞の増殖、分化にかかわる物質の遺伝子クローニングを試みた。すなわち、先ずヒト胎児肝細胞より抽出したmRNAよりcDNAを合成しヒト成人肝細胞mRNAと重複する分画をハイドロキシアパタイト法で除去し、胎児肝細胞に特有な発現cDNAライブラリーを高発現SRalphaプロモーターを有するpME18Sベクターを用いて作製した。今後は、モノクロナール抗体を用いて分離したCD34陽性細胞を対象にスクリーニング後、高度に幹細胞増幅能を有するcDNAのクローン化を行う予定である。

G-CSF is a factor for differentiation and proliferation of granulocyte lines. In response, we have demonstrated that G-CSF stimulation enhances gene expression, gene differentiation, and pluripotent hematopoietic stem cell differentiation in CML-CP patients with a single proliferative disorder. The characteristics of AML and its treatment are important to the development of pluripotent stem cells Methods: To prepare cDNA fragments from CML-CP patients 'bone marrow cells cultured in the presence of G-CSF for 18 hours, then to extract mRAN, lambdagt10cDNA fragments, G-CSF stimulated and non-stimulated CML cell-derived cDNA fragments, and to select 24 G-CSF-stimulated cDNA fragments. GIG-1 mRNA was approximately 0.9kb in length, and G-CSF stimulated the expression of GIG-1 mRNA in CML cells. In addition, we also use the same method to study the early fetal hematopoietic field and the important fetal liver cell development, hematopoietic stem cell proliferation, differentiation, and material transfer. cDNA synthesis in fetal liver cells and mRNA duplication in adult liver cells were performed using the pME18S protocol. In the future, the use of anti-CD34 antibodies to isolate CD34-positive cell targets will be determined after high stem cell amplification.

项目成果

Shimane,M.: "Molecular cloning and characterization of G-CSF induced gene cDNA." Biochem.Biophis.Res.Commun.(in press).

Shimane,M.：“G-CSF 诱导基因 cDNA 的分子克隆和表征。”

Takahashi,S.: "Recombinant human glycosylated granulocyte colony-stimulating factor(rhG-CSF)-combined regimen for a allogeneic bone marrow transplantation in refractory acute myeloid leukemia." Bone Marrow Transplant. (in press).

Takahashi,S.：“重组人糖基化粒细胞集落刺激因子 (rhG-CSF) 联合方案用于难治性急性髓系白血病的同种异体骨髓移植。”

Tani,K.: "Retrovirus-mediated gene transfer of human pyruvate kinase(PK)cDNA into muring hematopotetic cells:Implication for gene therapy of human PK deficiency." Blood. (in press).

Tani, K.：“逆转录病毒介导的人丙酮酸激酶 (PK) cDNA 基因转移到小鼠造血细胞中：对人类 PK 缺陷基因治疗的启示。”

Inoue,T.: "Combined therapy with interferon-alpha and methotrexate for the treatment of chronic myelogenous leukemia." The Mechanism and New Approach on Drug Resistance of Cancer Cells.272-282 (1993)

Inoue,T.：“干扰素-α 和甲氨蝶呤联合治疗慢性粒细胞白血病。”

Oshimi,K.: "Laboratory findings and clinical courses of 33 patients with granular Lymphocyte-proliferative disorders" Leukemia. 17. 782-788 (1993)

Oshimi,K.：“33 例粒状淋巴细胞增殖性疾病”白血病患者的实验室检查结果和临床过程。