基質小胞の生化学的単離法に対する再検討

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Hosokawa(1988)らにより基質小胞中にlactate dehydrogenase(LDH)が存在することが明らかにされて以来、我々は、従来の指標酵素であるalkaline phosphatase(ALP)と共に、LDHを利用して基質小胞画分を詳細に検討してきた。この結果、(1)この画分には、ALPを含まずLDHを含む性質の異なった小胞が混在しており、この小胞は、電顕的にALPを含む小胞とは電子密度が異なっていること(2)この画分には明らかに細胞のミクロソームが混入していることが電顕的に認められることなどの事実が明らかになってきた。もしも、この画分の純度が低く基質小胞が生化学的に単一でない物だとすれば、現在まで得られた多くの研究成果は、水泡に帰してしまう。そこで、この基質小胞の単離法について再検討を行ない基質小胞画分の純度の再検討を行なってきた。以下はその概要である。1.ミクロソームATPaseと形質膜のATPaseのそれぞれの特異抗体を用いた基質小胞画分の純度の検定基質小胞画分には、細胞のミクロソームがかなり混入していると思われる。そこで、形質膜由来と考えられる基質小胞のATPaseとミクロソームのATPaseが分子種が異なることを利用してそれぞれの特異抗体を用いてイムノタイトレーションや免疫組織化学的方法によりどの程度ミクロソームが混入しているかを調べた。その結果、使用した抗体の特異性に問題があり、確証的な結論は、得られていないが、ミクロソームの混入を多く認めるようなデータが得られつつある。2.ALPとLDHのイソ酵素に対する抗体を用いた基質小胞画分に対する免疫組織化学的検索基質小胞画分の中に、ALPを含まずLDHのみを含む小胞があることが明らかになってきたことから、両酵素の抗体を用いて免疫組織化学的方法によりどの程度LDHのみを含む小胞が混入しているかを調べた。結果としてLDHのバックグラウンドレベルが高く、免疫電顕のプロトコルを再検討中である。