脳で誘導される一酸化窒素(NO)合成酵素のシナプス形成、神経細胞死への関与の機序

大脑中诱导的一氧化氮（NO）合酶参与突触形成和神经元细胞死亡的机制

• 批准号: 05771966
• 负责人: 北村 佳久
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771966/
• 关键词: 一酸化窒素(NO); NOシンターゼ; 神経細胞; グリア細胞; エンドトキシン; サイトカイン; 神経細胞死; シナプス可塑性

ラット脳の一酸化窒素合成酵素(NOS)をNADPHジアホラーゼ染色すると小脳が強く染色され、海馬も染色された。ラット小脳から精製した分子量16万の一酸化窒素合成酵素(n-NOS)は、Ca^<2+>存在下カルモジュリン(CaM)によってL-アルギニンを基質としてNOを産生した。ウエスタンブロット解析から、小脳および海馬にはCaMが豊富に存在することが示唆された。小脳および海馬はシナプス可塑性モデルであるLTDおよびLTPが発現することが知られている。このことから、神経細胞にCa^<2+>が流入した時のみ、NOSは活性化されNOを産生すること、さらにシナプス可塑性に関与することが推定された。初代培養グリア細胞にはn-NOSは存在しないが、エンドトキシン(LPS)刺激によって分子量13万のNOS(i-NOS)が誘導され、大量のNOが産生されることを見い出した。i-NOSは、n-NOSと異なり、Ca^<2+>非依存的にCaMと結合し活性されることが示唆された。また、LPSによるi-NOS誘導はアクチノマイシンD(mRNA合成阻害薬)およびシクロヘキシミド(蛋白質合成阻害薬)処置によって完全に抑制された。グリア細胞のLPS刺激によって分子量12万の蛋白質がチロシンリン酸化され、i-NOS誘導がハービマイシンA(チロシンキナーゼ抑制薬)およびホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCによって抑制された。このことからLPSはCD14様蛋白質を介してチロシンキナーゼを活性化させ、i-NOS蛋白質を転写誘導することが推定された。さらに、誘導されたNOSを染色するとミクログリア細胞が強く染色され、アストログリア細胞も弱いながら染色された。また、NO産生するニトロプルシッド(SNP)によって神経細胞死が引き起こされたが、DBu-cGMP(Gキナーゼ活性化薬)では細胞死は起きないことを見い出した。さらに、SNPによってグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)がADPリボシル化が増強された。以上の結果から、NOによる神経細胞死には、Gキナーゼの活性化は関与せず、GAPDHなどのADPリボシル化が関与することが推定された。

当大鼠大脑中一氧化氮合酶（NOS）的NADPH diaphorase染色强烈染色时，也对海马染色也被染色。在存在Ca^<2+>的情况下，用钙蛋白（CAM）用L-精氨酸作为底物纯化的160,000个分子量的一氧化物合酶（N-NOS），从大鼠小脑中纯化了NO。蛋白质印迹分析表明，小脑和海马中的CAM丰富。已知小脑和海马表达LTD和LTP，即突触可塑性模型。这表明NOS被激活并产生NO，并且仅当Ca^<2+>涌入神经元时才参与突触可塑性。尽管N-NOS不存在于原代培养的神经胶质细胞中，但发现内毒素（LPS）刺激诱导的NOS（I-NOS）分子量为130,000，导致大量NO的产生。与N-NOS不同，建议通过以CA^<2+>独立的方式与CAM结合来激活I-NOS。此外，用放线菌素D（mRNA合成抑制剂）和环己酰亚胺（蛋白质合成抑制剂）治疗LPS的I-NOS诱导完全抑制了I-NOS。 LPS刺激神经胶质细胞引起蛋白质酪氨酸磷酸化，分子量为120,000，而I-NOS诱导抑制了Herbimycin a（酪氨酸激酶抑制剂）和磷脂酰辛基特异性磷酸磷脂酶C的抑制。此外，对诱导的NOS染色对小胶质细胞的染色也染色，而星形胶质细胞也被微弱染色。我们还发现，尽管没有产生硝基抑制（SNP）引起神经元细胞死亡，但DBU-CGMP（G激酶激活剂）并未引起细胞死亡。此外，SNP增强了甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的ADP核糖基化。从以上结果来看，估计G激酶的激活不参与NO引起的神经元死亡，而是涉及诸如GAPDH之类的ADP核糖基化。

项目成果

Yoshihisa Kitamura: "Stimulatory effects of protein kinase C and calmodulin kinase II on NMDA receptor/channels in the postsynaptic density of rat brain." Journal of Neurochemistry. 61. 100-109 (1993)

Yoshihisa Kitamura：“蛋白激酶 C 和钙调蛋白激酶 II 对大鼠大脑突触后密度 NMDA 受体/通道的刺激作用。”

Yoshihisa Kitamura: "Suppressive effect of FK-506,a novel immunosuppressant, against MPTP-induced dopamine-depletion in the striatum of young C57BL/6N mice." Journal of Neuroimmunology. (in press). (1994)

Yoshihisa Kitamura：“新型免疫抑制剂 FK-506 对年轻 C57BL/6N 小鼠纹状体中 MPTP 诱导的多巴胺消耗的抑制作用。”

Yoshihisa Kitamura: "Nitric Oxide-Roles in Neuronal communication and Neurotoxiciry-" Japan Scientific Societies Press and CRC Press (in press), (1994)

Yoshihisa Kitamura：“一氧化氮 - 在神经元通讯和神经毒性中的作用 -”日本科学会出版社和 CRC 出版社（印刷中），（1994 年）

Toshio Kaneda: "Presence of m3 muscarinic acetylcholine and receptor-mediated increases in the cytoplasmic concentration of Ca^<2+>in Jurkat,a human T lymphocyte line." Molecular Pharmacology. 43. 356-364 (1993)

Toshio Kaneda：“在人类 T 淋巴细胞系 Jurkat 中，m3 毒蕈碱乙酰胆碱的存在和受体介导的 Ca^2 细胞质浓度增加。”

Atsuhiro Miyazaki: "Characterization of [^3H]staurosporine binding in protein kinase C-II purified from rat brain." Neurochemistry International. 22. 455-464 (1993)

Atsuhiro Miyazaki：“从大鼠脑中纯化的蛋白激酶 C-II 中 [^3H]staurosporine 结合的表征。”