昆虫神経細胞に特異的に発現する糖鎖に関する研究

昆虫神经细胞特异表达的糖链研究

基本信息

批准号：
05780579
负责人：
岡昌吾
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780579/
关键词：
糖タンパク質 HRP 神経細胞昆虫ピリジルアミノ化糖鎖構造

项目摘要

近年、神経細胞に特徴的な糖鎖の存在が見いだされ、その生物学的意義が注目されている。なかでも西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)対する抗体がショウジョウバエをはじめとする昆虫神経系に特徴的に発現する糖鎖を認識することは良く知られている。しかし、その糖鎖の構造および機能については全く知られていない。そこで申請者は、神経系における糖鎖の生理的機能を解明する目的で、比較的入手が容易なイナゴより昆虫神経特異的に発現する糖鎖を含む糖タンパク質を単離し、その糖鎖構造の解析を試みた。イナゴ成虫16,000匹の頭部を脱脂後、0.9%塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液(PBS)を加えタンパク質を抽出した。抽出物を硫安分画した後、コンカナバリンAおよびレンチルを用いたレクチンクロマトグラフィーにより分画し、続いてPheny1-5PWを用いたHPLCを行い抗HRP抗体と反応性を示す35kDa糖タンパク質を精製した。ペプチドシークエンサーによりアミノ末端より20残基のアミノ酸配列を決定したところ、新規のタンパク質であることが明かとなった。35KdA糖タンパク質と抗HRP抗体との反応性は、alpha-マンノシダーゼ消化により消失することから、糖鎖の非還元末端に存在するalpha-マンノース残基が抗体との反応に重要であることが明かとなった。次に、抗HRP抗体と反応性を示す糖鎖抗原の構造を解析するために,35kDa糖タンパク質をヒドラジン分解することにより糖鎖を遊離させた後、ピリジルアミノ化(PA化)により蛍光標識を行った。このPA化糖鎖を陰イオン交換カラム、逆相カラム、アミノカラムを用いたHPLCにより分画したところ,HRP分子に発現していた糖鎖と非常によく似た糖鎖の存在が確認された。現在、本糖鎖の構造を NMRを用いて詳細に解析中である。

最近，已经发现了神经元的聚糖特征的存在，其生物学意义引起了人们的关注。众所周知，针对辣根过氧化物酶（HRP）的抗体识别在包括果蝇在内的昆虫神经系统中特征表达的糖链。但是，根本不知道糖链的结构和功能。因此，为了阐明聚糖在神经系统中的生理功能，申请人分离的糖蛋白含有含聚糖的糖蛋白，这些糖蛋白在昆虫神经中特别表达的糖蛋白比蝗虫相比相对容易获得，并试图分析这些聚糖的聚糖结构。降低16,000粒蝗虫的头部后，添加含有0.9％氯化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）以提取蛋白质。提取提取物通过硫酸铵分离后，使用凝集蛋白A和小扁豆通过凝集素色谱分离，然后使用苯基1-5PW进行HPLC纯化35KDA糖蛋白，该糖蛋白用抗HRP抗体反应性。使用肽测序仪确定来自氨基末端的20个残基的氨基酸序列，并发现它是一种新型蛋白质。 35KDA糖蛋白与抗HRP抗体的反应性因α-甘露糖苷酶消化而丧失，并且已经表明，在Gllycan的非还原端存在的α-甘露糖残基对于与抗体的反应很重要。接下来，为了分析与抗HRP抗体反应性的聚糖抗原的结构，通过氢津通过降解35 kDa糖蛋白来释放聚糖，然后通过吡啶基胺化（PA）进行荧光标记。当使用阴离子交换柱，反向相和氨基柱通过HPLC分馏该含PA的糖链时，可以证实存在与HRP分子中表达的糖链非常相似。当前，该聚糖的结构正在使用NMR进行详细分析。