ジーンターゲッティング法を用いたHNK-1糖鎖抗原の機能解析

利用基因打靶方法分析HNK-1糖抗原的功能

基本信息

批准号：
11159205
负责人：
岡昌吾
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

単クローン抗体HNK-1によって認識されるHNK-1糖鎖抗原は、3-スルホ-グルクロン酸という特徴的な糖鎖構造をエピトープとし、神経系特異的糖脂質、および、NCAMなどの神経接着分子に特徴的に発現している。本糖鎖抗原は神経の初期発生段階、神経回路の形成段階および神経回路の維持など様々な過程において重要な働きを持つことが示唆され注目されている。我々は、HNK-1糖鎖抗原の生合成に関与する酵素遺伝子(GlcAT-P、GlcAT-S)を単離し、これらを利用して分子生物学的手法により細胞レベル、及び個体レベルで本糖鎖抗原の役割を総合的に解明することを目指している。今年度の研究において以下に示す知見が得られた。1)GlcAT-P遺伝子の欠損したノックアウトマウスの作成及びその解析既に作成済みのヘテロ変異マウスよりGlcAT-P遺伝子を欠損するホモ異変マウスを得た。ホモ異変マウスにおける本酵素の欠損はサザン、ノーザン解析法を用いて確認した。またGlcAT-P遺伝子欠損マウスではHNK-1糖鎖抗原の大部分は消失していたが、一部特徴的な領域にHNK-1糖鎖の発現の残存が観察された。この結果は脳組織におけるHNK-1エピトープの大部分はGlcAT-Pにより合成されるが、もう一つの合成酵素であるGlcAT-Sによってもその発現が制御されていることを示している。欠損マウスの脳組織には顕著な形態異常は見いだされていないが、アストログリア細胞のマーカーとして知られているGFAP(Glial fibrillary acidic protein)の分布が正常マウスと大きく異なることが観察された。2)第2のグルクロン酸転移酵素遺伝子の単離とノックアウトマウスの作成1)の研究の結果、GlcAT-P遺伝子欠損マウスでは完全にHNK-1糖鎖の発現が消失しないことが明らかとなった。そこで、HNK-1糖鎖生合成に関与する第2のグルクロン酸転移酵素遺伝子(GlcAT-S)の欠損マウスの作成のため、まずGlcAT-S遺伝子をマウスの遺伝子ライブラリーから単離し、その構造解析を行った。その結果、本遺伝子は4つのエクソンから構成されていることが明らかとなった。またエクソンとイントロンのジャンクション部位はAG-GT則に従っていることが明らかとなった。

由单克隆抗体HNK-1识别的HNK-1糖基化抗原具有一个称为3-硫葡萄醛酸的独特的聚糖结构的表位，并且在神经系统特异性糖脂中的特征是表达，并在诸如NCAM之类的神经系统特异性糖脂中表达。已建议这种糖基化抗原具有重要的功能，例如神经的初始发育阶段，神经回路的形成阶段以及维持神经回路以及引起人们的注意。我们分离了参与HNK-1糖抗原（Glcat-P，Glcat-S）的生物合成的酶基因，并使用它们使用分子生物学技术在细胞和个体水平上全面阐明了该聚糖抗原的作用。今年的研究提供了以下发现：1）用缺陷的GLCAT-P基因创建和分析敲除小鼠，我们获得了来自已经创建的异源小鼠缺乏GLCAT-P基因的同源异常小鼠。使用南部和北方分析方法证实了该酶在同源小鼠中的缺乏。此外，在缺乏Glcat-P基因的小鼠中丢失了大多数HNK-1糖抗原，但是在某些独特的区域中观察到HNK-1聚糖的残留表达。该结果表明，脑组织中的大多数HNK-1表位是由GLCAT-P合成的，但它们的表达也受到另一个合酶Glcat-S的调节。尽管在有缺陷的小鼠的脑组织中未发现明显的形态异常，但据观察，GFAP（神经胶质原纤维酸性蛋白）的分布（称为星形胶质细胞标记物）与正常小鼠的分布显着不同。 2）分离第二葡萄糖醛酸转移酶基因和基因敲除小鼠的创造表明，缺乏GLCAT-P基因的小鼠中HNK-1聚糖表达并没有完全消失。因此，为了创建缺乏参与HNK-1聚糖生物合成的第二种葡萄糖醛酸转移酶基因（GLCAT-S）的小鼠，首先将Glcat-S基因从小鼠基因文库中分离出来，并分析结构。结果，发现该基因由四个外显子组成。还揭示了外显子和内含子的连接点遵循AG-GT规则。