神経細胞に特異的な糖タンパク質に関する分子生物学的研究

神经细胞特异性糖蛋白的分子生物学研究

基本信息

批准号：
07772166
负责人：
岡昌吾
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772166/
关键词：
神経細胞糖鎖抗原西洋ワサビペルオキシダーゼ昆虫

项目摘要

1)糖タンパク質の精製および部分アミノ酸配列の決定凍結乾燥したイナゴ頭部を、クロロホルム/メタノールで脱脂後、0.9%塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液(PBS)で糖タンパク質を抽出した。この抽出物を材料に、ウエスタンブロットにおける抗HRP抗体との反応性を指標として、硫安分画、ConAカラム、抗HRP抗体を固定化したアフィニティーカラムにかけ、最終的に調製用電気泳動で分画し、43kDaおよび35kDaの糖タンパク質を精製した。ペプチドシークエンサーにより、この35kDaの糖タンパク質のアミノ末端より20残基のアミノ酸配列を決定した。またこの35kDa糖タンパク質をリシルエンドペプチダーゼで消化後、逆相HPLCで分離したペプチド画分についてアミノ酸配列を決定した。2)糖鎖の精製および構造決定精製した43kDa糖タンパク質をヒドラジン分解で糖鎖を切り出し、還元末端を2-アミノピリジンと反応させピリジルアミノ化(PA化)することにより蛍光標識した。このPA化糖鎖を、逆相カラム、アミドカラムを用いて分画し、数種の画分を得た。そのうちの主要な画分が、HPLCにおいてHRP糖鎖とよく似た挙動を示したので、この画分が抗HRP抗体と反応性を示す糖鎖であると思われた。そこでこの画分を、イオンスプレー式質量分析計を用い、MSおよびMS/MS分析を行った結果、HRP糖鎖と同じパターンを示した。また、この糖鎖を600MHz1H-NMRで測定した結果、HRP糖鎖と同じパターンを示した。このことより、イナゴの神経系に発現している、抗HRP抗体と反応性を示す糖鎖は、HRP糖鎖と同じ構造であることが示唆された。

1）用氯仿/甲醇纯化糖蛋白和部分氨基酸序列的测定，然后用含有0.9％氯化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）萃取糖蛋白。将该提取物作为材料，使用抗HRP抗体的反应性作为索引，将提取物应用于硫酸铵馏分上，CONA柱和亲和力柱，其中抗HRP抗体被固定，并通过制备电动膜通过纯化的pupureified Glycoproteins of 43 kda和35 kda进行了纯化的电溶膜分解。来自该35 kDa糖蛋白的20种残基的氨基酸序列由肽序列确定。此外，在用赖氨酸内肽酶消化这种35 kDa糖蛋白后，确定了氨基酸序列的肽级序列，该氨基酸序列是由反向相HPLC分离的肽级分。 2）将纯化的43 kDa糖蛋白的纯化和结构测定对糖链分解，并将还原的末端与2-氨基吡啶对吡啶基胺化（PA）反应，以荧光标记纯化的43 kDa糖蛋白。使用反向相位柱和酰胺柱分馏该含PA的糖链以获得几个分数。这些主要部分表现出与HPLC中HRP聚糖相似的行为，并且人们认为这部分是一种用抗HRP抗体反应性的聚糖。因此，使用离子喷雾质谱仪在此馏分上进行了MS和MS分析，结果显示与HRP聚糖的模式相同。此外，用600MHz 1H-NMR测量了糖链，并显示出与HRP糖链相同的模式。这表明在蝗虫神经系统中表达的抗HRP抗体反应性的聚糖具有与HRP聚糖相同的结构。