神経細胞に特異的な糖タンパク質に関する分子生物学的研究

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1)糖タンパク質の精製および部分アミノ酸配列の決定凍結乾燥したイナゴ頭部を、クロロホルム/メタノールで脱脂後、0.9%塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液(PBS)で糖タンパク質を抽出した。この抽出物を材料に、ウエスタンブロットにおける抗HRP抗体との反応性を指標として、硫安分画、ConAカラム、抗HRP抗体を固定化したアフィニティーカラムにかけ、最終的に調製用電気泳動で分画し、43kDaおよび35kDaの糖タンパク質を精製した。ペプチドシークエンサーにより、この35kDaの糖タンパク質のアミノ末端より20残基のアミノ酸配列を決定した。またこの35kDa糖タンパク質をリシルエンドペプチダーゼで消化後、逆相HPLCで分離したペプチド画分についてアミノ酸配列を決定した。2)糖鎖の精製および構造決定精製した43kDa糖タンパク質をヒドラジン分解で糖鎖を切り出し、還元末端を2-アミノピリジンと反応させピリジルアミノ化(PA化)することにより蛍光標識した。このPA化糖鎖を、逆相カラム、アミドカラムを用いて分画し、数種の画分を得た。そのうちの主要な画分が、HPLCにおいてHRP糖鎖とよく似た挙動を示したので、この画分が抗HRP抗体と反応性を示す糖鎖であると思われた。そこでこの画分を、イオンスプレー式質量分析計を用い、MSおよびMS/MS分析を行った結果、HRP糖鎖と同じパターンを示した。また、この糖鎖を600MHz1H-NMRで測定した結果、HRP糖鎖と同じパターンを示した。このことより、イナゴの神経系に発現している、抗HRP抗体と反応性を示す糖鎖は、HRP糖鎖と同じ構造であることが示唆された。