卵成熟誘起におけるホルモンの作用機構に関する分子生物学的研究:卵成熟誘起ホルモン(MIH)による卵成熟促進因子(MPF)活性化の分子メカニズム

激素诱导卵母细胞成熟作用机制的分子生物学研究：卵母细胞成熟诱导激素（MIH）激活卵母细胞成熟促进因子（MPF）的分子机制

• 批准号: 05740501
• 负责人: 平井 俊朗
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Teikyo University of Science & Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05740501/
• 关键词: 卵成熟誘起ホルモン(MIH); 卵成熟促進因子(MPF); 卵成熟; cdk2キナーゼ; プロテインキナーゼ; cDNA

ホルモンによる卵成熟キナーゼカスケード活性化機構の解明を目指し、その構成分子の分子生物学的単離、同定を試み、以下の成果を得た。キンギョ未成熟卵を卵成熟誘起ホルモン:17alpha,20beta-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン存在下で培養し、経時的に回収した卵細胞質よりcdk2キナーゼを免疫沈降してヒストンH1キナーゼ活性を測定したところ、cdk2活性は減数第一分裂中期頃より上昇し始め、減数第二分裂中期に最高値に達したが活性はcdc2キナーゼの1/10程度であった。一方cdc2とは異なり、間期と成熟卵賦活後における不活性化は見られなかった。また、卵成熟過程においてcdk2タンパク質ならびにmRNA量に顕著な変動は見られなかった。キンギョ成熟卵cDNAライブラリーよりプロテインキナーゼの共通領域をコードする合成オリゴヌクレオチドをプローブとしてスクリーニングを行い、4種6個のクローンを単離し、塩基配列を決定した(以下GFKINと呼ぶ)。推定されるアミノ酸配列に対する相同配列をデータベースで検索したところ、既知のものはなかったが体細胞分裂関連キナーゼのいくつかと低い相同性が見出された。特にGFKIN5と12は出芽酵母S.cerevisiaeのKIN3キナーゼおよびA.nidulansのNIMAキナーゼに、またGFKIN7と9はMAPキナーゼファミリーにそれぞれ30〜40%の相同性を持っていた。また、ノーザンブロット分析で当該遺伝子の発現が生殖腺でのみ検出されたことからこれらのキナーゼが卵成熟過程に何らかの機能を果たしているものと推測された。これらのcDNAに対する大腸菌組換えタンパク質を作製し、マウスに免疫したがcDNA産物を認識する抗体は今のところ得られておらず、現在複数の異なるタンパク質発現系を用いて再試行している。

我们试图通过激素阐明卵成熟激酶级联反应的机理，并尝试将分子生物学分离并鉴定其成分分子，从而产生以下结果。在存在卵成熟诱导的激素的情况下培养金鱼的未成熟卵：17Alpha，20beta-dihydroxy-4-4-Pregnen-3-One，并且CDK2激酶从卵细胞质中免疫沉淀，从时间内收集，并测量了H1 KINase活性。 CDK2活性从减数分裂第一的减数分裂减数分裂开始上升，并在减数分裂第二减数分裂中达到最高水平，但该活性约为CDC2激酶的1/10。另一方面，与CDC2不同，在相间或成熟卵激活后未观察到失活。此外，在鸡蛋成熟过程中，CDK2蛋白或mRNA的量未观察到显着变化。从腌制的鸡蛋cDNA文库中筛选了编码蛋白激酶共同区域的合成寡核苷酸作为探针，并分离了6种的6个克隆，并确定了基本序列（以下称为Gfkin）。一个数据库搜索针对推导的氨基酸序列的同源序列发现与某些与体细胞分裂相关的激酶的同源性低，尽管没有人知道。特别是，GFKIN5和12与A. nidulans的酿酒酵母的Kin3激酶和NIMA激酶具有30-40％的同源性，而GFKIN7和9与MAP激酶家族分别具有30-40％的同源性。此外，仅在北印迹分析中的性腺中检测到基因的表达，并且据推测这些激酶在卵成熟过程中发挥了一定的功能。重组大肠杆菌蛋白针对这些cDNA产生并免疫小鼠，但尚未获得识别cDNA产物的抗体，目前使用几种不同的蛋白质表达系统重试。