肝炎の治療を目的とする遺伝子改変B型肝炎ウイルスの構築

用于治疗肝炎的转基因乙型肝炎病毒的构建

基本信息

批准号：
05857063
负责人：
花房直志
金额：
$ 0.51万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05857063/
关键词：
HBV ベクターリボザイムアンチセンスDNA

项目摘要

この研究はB型肝炎の治療に利用可能な遺伝子改変B型肝炎ウイルス(HBV)ベクターの構築を目的としている。ヒトに対する病原性の問題から、in vivoでは増殖しないようにするため、P遺伝子の温度感受性変異の導入を最初の目的とした。しかしながらin vitroでのHBVの複製にX遺伝子が不要であること、逆にin vivoでの複製にはX遺伝子は必須であること等が最近の知見から明らかになった。従って当初の目的はX遺伝子を破壊することによって可能である事が解り、P遺伝子への変異の導入に関する実験は途中で中止された。遺伝子改変HBVベクターの構築のため、まず約60塩基対の合成DNAリンカーをP遺伝子のC末端側に挿入したHBV配列(HBVL60:3284bp)を作成した。HBVL60は完全なPreC,C,PreS,S,およびP遺伝子を持つが、X遺伝子はリンカーの挿入により破壊されている。HBVL60を基に作成した種々のプラスミドの培養細胞における複製を調べた結果、肝ガン由来のHuH-7においてHBVL60ダイマーは複製可能であること、HepG2においてもトランスでX遺伝子を供給するとHBVL60ダイマーは複製可能である事を示した。従ってHBVは少なくとも63塩基対の異種DNAを運ぶことが可能であることが明らかにされた(学会および報文にて発表準備中)。またHepG2での結果からHBVL60ダイマーはin vivoでは複製能を持たないことが予測された。HBVL60を基にクローニング部位を持つベクターpGHBV501を作成したので、今後はHBV遺伝子の各種変異の単離、HBVのパッケージング可能なDNAのサイズの検討、リボザイムやアンチセンスDNAを用いた野生型HBVの複製に及ぼす影響等を検討していく予定である。

这项研究旨在构建可用于治疗丙型肝炎的遗传修饰的丙型肝炎病毒（HBV）载体。由于人类的致病性问题，最初的目的是引入P基因的温度敏感突变，以防止其在体内生长。然而，最近的发现表明，X基因在体外不是HBV复制所必需的，并且X基因对于体内复制至关重要。因此，发现最初的目的是通过破坏X基因的可能性，并且将突变引入P基因中的实验已在中途停止。为了构建遗传修饰的HBV载体，首先创建了HBV序列（HBVL60：3284BP），在P基因的C末端插入了大约60个合成DNA接头的基础对。 HBVL60具有完整的PREC，C，PRES，S和P基因，但是X基因被接头插入破坏了。基于培养细胞中HBVL60产生的各种质粒的复制表明，HBVL60二聚体能够在HUH-7中复制，该二聚体是从肝癌中得出的，并且当X基因由Trans提供时，可以在HEPG2中复制HBVL60二聚体。因此，已经揭示了HBV能够至少携带63对异源DNA（准备在学术会议和论文中进行演示）。此外，HEPG2的结果预测HBVL60二聚体在体内没有复制能力。我们已经使用基于HBVL60的克隆位点创建了Vector PGHBV501，现在将考虑HBV基因中各种突变的隔离，可以在HBV中包装的DNA的大小，以及它对使用Robozymes和抗固定剂DNA复制的HBV复制的影响。