RLGS法、AP-PCR法を用いた肝癌染色体ゲノムの解析

RLGS法和AP-PCR法分析肝癌染色体基因组

基本信息

批准号：
09770359
负责人：
花房直志
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770359/
关键词：
肝癌 RLGS AP-PCR ゲノムメチレーションゲノムのメチル化 RLGS法 AP-PCR法

项目摘要

癌細胞における遺伝子発現の変化は遺伝子の突然変異、メチル化状態の変化、および染色体数の変化や増幅による量的変化によるものであると考えられる。本研究ではRLGS法およ調V-PCR一SSCP法で検出された各種の変異を、詳細にカタログ化するとともに、変異部位の染色体へのマッピング、およびゲノムのメチル化部位、脱メチル化部位の染色体へのマッピングを目的とした。行なった研究の実績は以下のとおりである。(1)RLGS法の改良:縦型の泳動槽を用いる手法の利点を取り入れ、より正確なランドマーク像が一度に多く得られるよう改良を加えた。(2)効率的なRLGSスポットのクローニング法の開発:鈴木らにより報告されたPCR法を用いたクローニング法を元にラベリングとアダプターに改良を加え、1度の電気泳動でクローニング可能な手法を開発した。この手法を用いて行なったRLGSスポットのクローニング解析については第34回日本肝臓学会(1998年)において報告した。ここでは肝癌において多く観察されたRLGSスポットの変化の多くが反復配列のメチル化の変化によることを報告した(投稿準備中)。(3)AP-PCR法によるメチル化部位の検出:鋳型となるゲノムDNAをメチル化感受性制限酵素Msp I等で切断したものを出発材料としたAP-PCR解析(メチル化特異的AP-PCR法)のシステムを作成し、この方法によりランダムなメチル化に関与するゲノムのSTS(Sequence tagged site)マーカーを集めることができることを示した。

癌细胞中基因表达的变化被认为是由于基因突变，甲基化状态的变化以及由于染色体数量和扩增而导致的定量变化。这项研究详细列出了通过RLGS方法和V-PCR SSCP方法检测到的各种突变，旨在将突变位点映射到染色体，并映射甲基化位点和脱甲基化位点，以归为基因组中的染色体。进行的研究结果如下：（1）RLGS方法的改进：采用了使用垂直型运行罐的方法的优势，并进行了改进以立即获得更准确的地标图像。（2）开发一种有效的RLGS斑点克隆方法：基于使用Suzuki等人报道的PCR方法的克隆方法，我们开发了一种可以由一个电泳克隆的方法。第34届日本肝科学学会（1998）报道了使用该技术进行的RLGS点的克隆分析。在这里，我们报告说，在肝癌中观察到的RLGS斑点的许多变化都是由于重复序列的甲基化变化（为发布准备）。（3）使用AP-PCR方法检测甲基化位点：我们使用基因组DNA创建了一个用于AP-PCR分析的系统（甲基化特异性AP-PCR方法），该系统用作模板，该模板用甲基化敏感的限制酶MSP I等裂解，并作为起始材料作为起始物质，并证明了该方法可以随机收集STS（序列标记的位置），其中涉及基因的标记。