遺伝子改変B型肝炎ウイルスのパッケージングと複製効率の改良

提高转基因乙型肝炎病毒的包装和复制效率

• 批准号: 07770366
• 负责人: 花房 直志
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770366/
• 关键词: HBV; ベクター; GFP

平成5年度の奨励研究(A)交付金による研究により、われわれは唯一の肝特異的なDNAウイルスであるHBVをベクター化し(pGHBV501)、in vitroでの複製を示した。このベクターは異種DNA配列を運搬可能である、培養細胞では複製可能であるが、生体内では複製しえないなど、ベクターとして好ましい条件を備えている。本研究は作成したHBVベクターを元に、その増殖とパッケージング能の改良を目的に研究を行った。(1)宿主培養細胞株の作成:X遺伝子を発現するプラスミドpHBVM101を薬剤耐性プラスミドpSV2-bsrと供にHuH-7株にトランスフェクションし、安定な形質転換体を単離した。このなかからX遺伝子を発現する株を選択し、宿主培養細胞株(HTBM101)とした。(2)パッケージング能の検討:pGHBV501は63bpの異種DNA配列を運ぶことが可能であることを示したが、クローニング可能な制限酵素の部位としてHindIIIのみしか持たないので、新たなクローニング部位を持つプラスミドpGHBV601を作成し、パッケージング可能なDNAの大きさを検討した。用いるDNA断片には、λ/HindIII断片、pMSG-CAT/HindIII-XhoI断片、HCVenv遺伝子断片、GFP遺伝子などを検討した。これらの過程で、λ/HindIII分解物の125塩基対の断片においても、その挿入によりパッケージング能が著しく低下することが判明した。いっぽう、細胞内でのHBVゲノムの複製は750塩基対程度の断片をクローン化した場合でも見られることを示した。(3)HBV遺伝子の変異の単離:Green fluorescent protein(GFP)を用いると、その遺伝子発現を蛍光顕微鏡などによりin situで観察することができる。そこでHBVベクターに野生型GFPおよび蛍光波長の異なる変異型GFP(pS65T)をクローン化したプラスミドを作成した。この2種のプラスミドを同一の細胞に形質転換し、得られた形質転換体の蛍光発光の変化からHBV遺伝子の種々の変異が単離できると考え現在研究を進めている。

Pingcheng 5 years of research (A) delivery of the gold to study the disease, the only liver disease of the DNA, the liver, the HBV of the disease (pGHBV501), the in vitro copy of the show. All kinds of DNA should be equipped with different kinds of equipment, such as possible transfer, cell replication, in vivo replication, and proper conditions. The purpose of this study is to improve the quality of HBV and to study the behavior of human beings. The main results are as follows: (1) the host culture cell line was made: X-ray cell line was isolated from HuH-7 strain in the form of diazepam, pHBVM101, tolerance, tolerance and pSV2-bsr. The host culture cell line (HTBM101) was selected and the host cell line was selected. (2) the equipment of pGHBV501 63bp DNA may be used to show that it is possible to show that it is possible to limit the production of enzymes in the part where the enzyme is used, and that the parts of the new system can be made by holding the pGHBV601, and the DNA may be made by the new device. Use "DNA fragment", "λ