非天然型アミノ酸の部位特異的導入法によるチトクロムP450アミノ酸残基の役割の証明

通过位点特异性引入非天然氨基酸来证明细胞色素 P450 氨基酸残基的作用

• 批准号: 06780488
• 负责人: 木股 洋子
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780488/
• 关键词: チトクロムP450; 非天然型アミノ酸; タンパク質工学; 酵素触媒機構

チトクロムP450の幾つかの活性部位アミノ酸残基を部位特異的に非天然型アミノ酸で置換する系の確立を目指して、先ずP450camの252位へのスレオニン誘導体の導入を実施した。252位のスレオニンは従来のアミノ酸置換法による解析から、その水酸基の酸触媒としての役割が提唱されていた。本研究ではこれを検証するために、スレオニンの水酸基がメチル基で保護され酸触媒として働き得ないO-メチルスレオニン(OMe-Thr)を252位へ導入し、その酵素活性への影響を解析することを試みた。その結果を以下に述べる。1.P450camの252位へOMe-Thrを導入することに成功した。これは国内で、又、ヘム蛋白質として初めての非天然型アミノ酸の部位特異的導入例である。2.252位へOMe-Thrを導入した変異P450camを大量合成、部分精製し、酵素活性測定や分光学的解析に必要な量及び純度のP450camホロタンパクの調整法を確立した。3.上記の変異P450camの機能解析から、252位スレオニンの水酸基が遊離型であることはP450camの触媒作用に必須条件でないことが明らかになった。従って、従来のスレオニンの水酸基の酸触媒説を修正した新しい仮説-スレオニン水酸基の酸素との水素結合によって保持された水分子が酸触媒として働く-を提唱した(BBRC,1995 印刷中)。今後この新しい仮説を更に検証するため、種々の水素結合能を有するスレオニン誘導体の252位への導入を行うと共に、今回確立した手法を用いてP450camの他の活性部位アミノ酸残基の役割の解析を実施することを計画している。

The introduction of an inducer at position 252 of P450 cam was carried out in order to establish a site-specific system for the substitution of acid residues in the active site of P450cam. The 252-position catalyst was prepared by acid replacement method. In this study, we investigated the effects of OMe-Thr on enzyme activity and the effect of OMe-Thr on enzyme activity. The results are described below. 1. P450cam 252-bit OMe-Thr was successfully imported. This is a site-specific introduction of non-natural proteins. 2.252 A method for mass synthesis, partial purification, enzyme activity determination, and optical analysis of P450cam was established. 3. The function analysis of different P450cam is described above. The 252-bit structure of P450cam is free. The necessary conditions for the catalytic action of P450cam are as follows: The theory of hydro-acid-based acid catalyst is revised and updated in the future. The theory of hydro-acid-based acid catalyst is revised and updated in the future.(BBRC,1995) In the future, the new method for the analysis of P450cam and other active sites is proposed.

项目成果

木股洋子: "Role of Thr-252 in cytochrome P450cam:A study with unnatural amino acid mutagenesis" Biochemical and Biophysical Research Communications. (発表予定). (1995)

Yoko Kimata：“Thr-252 在细胞色素 P450cam 中的作用：非自然氨基酸诱变研究”《生物化学和生物物理研究通讯》（即将出版）。